銀-銅/還原氧化石墨烯修飾的玻碳電極測定當歸中的阿魏酸

葉鴻清，賴木深，朱明芳，梁煥如，梁學彬

(廣東藥科大學藥學院，廣東 廣州 510006)

阿魏酸即3-甲氧基-4-羥基肉桂酸，具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗紫外線輻射、抗自由基和人體免疫系統調節等藥理活性，在疾病預防和治療中起著重要的作用[1-3]。目前，阿魏酸在臨床上主要用于治療冠心病、腦血管阻塞、血管炎以及白細胞和血小板減少等疾病，另外在保健食品、化妝品和營養補充劑中也有重要應用[4]。常用的阿魏酸測定方法包括薄層色譜法[5]、高效液相色譜法[6]、毛細管電泳法[7]、熒光分光光度法[8]、電化學測定法[9-10]等。電化學方法因具有高靈敏度和低成本等優點，在藥物、染料、殺蟲劑和無機物檢測上引起了極大的關注。文獻報道的阿魏酸電化學測定主要應用的是其氧化峰，本課題組也曾用碳糊電極陰極溶出伏安法測定阿魏酸的氧化峰[11]。用雙金屬納米顆粒負載還原的氧化石墨烯復合材料修飾的玻碳電極測定阿魏酸的還原峰的研究未見文獻報道。

銀-銅雙金屬納米顆粒具有電化學催化作用，已被用于許多無酶電化學傳感器的研究中[12]。但金屬納米材料容易發生聚集，會大大降低其電化學性能，因此限制了其使用。據文獻報道，金屬納米顆粒與還原氧化石墨烯組成的復合材料，不僅具有金屬本身的性能，而且可使還原的氧化石墨烯片層間距增大，優化了石墨烯單層的獨特性能；同時，還原氧化石墨烯和無機納米粒子能產生協同效應，具有潛在應用價值[13-15]。

本文將合成的銀-銅雙金屬/還原氧化石墨烯復合材料修飾在玻碳電極上，在0.30 V處測定阿魏酸的還原峰，建立了測定當歸中阿魏酸的新方法。修飾的玻碳電極對阿魏酸有較好的電化學響應，響應快、靈敏度高，也有望用于其他中藥中阿魏酸質量分數的測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

CHI1242B型電化學工作站(上海辰華儀器有限公司)；三電極系統：玻碳電極(直徑3 mm)及修飾電極為工作電極，鉑電極為輔助電極，飽和甘汞電極為參比電極；KQ-50E型超聲波清洗器(江蘇省昆山市超聲儀器有限公司)；pHS-25型pH計(上海智光儀器儀表有限公司)。

1.2 試藥

阿魏酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：1517121，質量分數為99%)；CuSO4·5H2O(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；AgNO3(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；氧化石墨烯(蘇州碳豐科技有限公司)；NaBH4(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；當歸(廣東逢春制藥有限公司，批號分別為190201A03、190201A04、190201A05)；其他試劑均為分析純；實驗用水為去離子水。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取阿魏酸10.0 mg，用5 mL無水乙醇超聲溶解，加水定容于50 mL的容量瓶中，得到濃度為1.03 mmol/L阿魏酸對照品儲備液。精密移取適量儲備液，用B-R緩沖溶液(pH 5.96)稀釋，得到一系列不同濃度的阿魏酸對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱定當歸粉末(過三號篩)0.2 g，置于具塞錐形瓶中，加入無水乙醇20 mL，密塞、稱定質量，于45 ℃加熱回流30 min，放冷，加入無水乙醇補足減少質量，搖勻后靜置，取上清液，濾過，取續濾液即為供試品溶液。

2.2 銀-銅雙金屬/還原氧化石墨烯復合材料的合成

參考文獻[14]稱取CuSO4·5H2O 0.250 0 g和AgNO30.169 9 g于三頸瓶中，依次加入20 mL去離子水、10 mL氧化石墨烯水溶液(1.0 mg/mL)、10 mL檸檬酸鈉(0.02 mol/L)，加熱到25 ℃后持續攪拌反應30 min。然后逐滴加入0.2 mol/L的NaBH4溶液20 mL，25 ℃下繼續攪拌反應1 h。反應完成后靜置冷卻至室溫，再用去離子水和無水乙醇清洗抽濾3次，將所得固體置于25 ℃烘箱中，直至完全干燥，所得產物存放在4 ℃冰箱中，備用。同法制備不含還原氧化石墨烯的銀-銅雙金屬納米顆粒。

2.3 銀-銅雙金屬/還原氧化石墨烯修飾電極的制備

將玻碳電極分別用2.5、0.5 μm Al2O3漿料拋光直至鏡面，再依次用水和乙醇超聲處理，在室溫下空氣中干燥，得到預處理的玻碳電極(GCE)。取合成的銀-銅雙金屬/還原氧化石墨烯復合材料0.5 mg于1 mLN，N-二甲基甲酰胺溶劑中，超聲溶解1 h，吸取此溶液10 μL滴涂于預處理后的玻碳電極上，所制備的修飾電極用Ag-Cu@rGO/GCE表示。同法制備銀-銅雙金屬納米顆粒修飾的玻碳電極(Ag-Cu/GCE)、還原氧化石墨烯修飾的玻碳電極(rGO/GCE)。

2.4 電化學測量方法

在pH 5.96的B-R緩沖溶液中，以自制的修飾電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑電極為對電極，用差分脈沖伏安法測定阿魏酸濃度與對應電流的線性關系，得出檢出限。同時對修飾電極進行精密度、重復性、穩定性、選擇性測試，最后進行樣品測定。差分脈沖伏安法的條件為：初始電位0.1 V，終止電位0.7 V，電位增量0.01 V，脈沖幅度0.05 V，脈沖寬度0.05 s。

2.5 不同電極的電化學交流阻抗

GCE和Ag-Cu@rGO/GCE在5.0 mmol/L鐵氰化鉀溶液中的交流阻抗圖譜見圖1。

a. Ag-Cu@rGO/GCE; b.GCE。

圖1不同電極的電化學交流阻抗圖

Figure1Electrochemical AC impedance diagram of different electrodes

在阻抗圖譜中，半圓的直徑在數值上等于電極的電荷轉移電阻(Ret)[16]。由圖1可知，GCE比Ag-Cu@rGO/GCE的電阻大，說明在電極表面上修飾銀-銅雙金屬/還原氧化石墨烯復合材料能降低電極阻礙電子傳遞的能力，并提高電極的電催化性能。

2.6 差分脈沖伏安法測定當歸中的阿魏酸

2.6.1 線性關系及檢測限 按照“2.1.1”項下方法分別配制濃度為1.03×10-7、4.12×10-7、6.18×10-7、1.03×10-6、2.06×10-6、6.18×10-6、8.24×10-6mol/L的阿魏酸對照品溶液，按“2.4”項下方法對不同濃度的阿魏酸進行測定，結果見圖2。可見，阿魏酸的濃度在0.103～8.24 μmol/L時，峰電流隨著濃度的增大而增大，并且存在良好的線性關系，線性方程為Ipc=2.670 9c+3.434 9(其中：Ipc為峰電流，μA；c為阿魏酸濃度，μmol/L)，r=0.998 4，檢測限為0.033 μmol/L(S/N=3)

2.6.2 選擇性試驗 按“2.1”項下方法配制1.03 μmol/L的阿魏酸對照品溶液，按“2.4”項下方法進行干擾實驗。結果顯示，10倍濃度的芥子酸、熊果酸、香草酸等酸性物質對阿魏酸測定幾乎沒有干擾，50倍濃度的常見無機離子，如Mg2+、Co2+、Cu2+、K+、Mn2+、Fe3+以及SO42-，對測定幾乎無影響，說明該修飾電極對阿魏酸有良好的選擇性。

2.6.3 精密度試驗 按“2.1.1”項下方法配制5.15 μmol/L的阿魏酸對照品溶液，按“2.4”項下方法連續測定7次，結果測得峰電流的RSD值為1.2%，表明方法精密度良好。

a～g：阿魏酸溶液濃度依次為1.03×10-7、4.12×10-7、6.18×10-7、1.03×10-6、2.06×10-6、6.18×10-6、8.24×10-6mol/L。

圖2不同濃度的阿魏酸在Ag-Cu@rGO/GCE的差分脈沖伏安圖(插入圖：阿魏酸的濃度與還原峰電流的校正曲線圖)

Figure2Differential pulse voltammogram of different concen-trations of ferulic acid in Ag-Cu@rGO/GCE (Inset: Calibration curves of ferulic acid concentration and reduction peak current)

2.6.4 重復性試驗 按“2.1.2”項下方法配制供試品(批號：190201A03)溶液6份，按“2.4”項下方法進行測定，結果測得阿魏酸的平均質量分數為0.782 0 mg/g，RSD值為2.2%，表明方法重復性良好。

2.6.5 穩定性試驗 按“2.1.2”項下方法配制供試品(批號：190201A03)溶液，按“2.4”項下方法連續5 d用差分脈沖伏安法測定，測得峰電流的RSD值為3.4%，表明方法穩定性良好。

2.6.6 回收率試驗 精密稱取同一批次(批號：190201A03)當歸粉末0.2 g，共6份，分別精密加入阿魏酸對照品高、中、低3個濃度的對照品溶液，按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，根據“2.4”項下方法用Ag-Cu@rGO/GCE進行回收率測定。

作為比較，同時采用HPLC法[17]進行回收率測定，色譜條件如下：色譜柱為YMC-Triart C18column(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-5%磷酸水溶液(體積比為25∶75)，紫外檢測波長為316 nm。

結果顯示，電化學法測定的平均加樣回收率為104.3%，HPLC法測得的平均加樣回收率為100.8%，且RSD均小于2%，見表1。

2.6.7 樣品分析 取3個批號當歸樣品，按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，根據“2.4”項下方法用Ag-Cu@rGO/GCE對供試品中的阿魏酸進行電化學測定，同時采用HPLC法[17]測定進行比較。結果顯示，3批當歸中阿魏酸的質量分數在0.773 6～0.786 4 mg/g之間，見表2。

表1 當歸中阿魏酸的加樣回收率測定結果Table 1 Determination of the recovery of ferulic acid in Angelica sinensis (n=3)

表2當歸中阿魏酸的質量分數測定結果

Table2Determination results of the content of ferulic acid inAngelicasinensis(n=3)

批次測定方法w(阿魏酸)/(mg·g-1)RSD/%190201A03Ag-Cu@rGO/GCE0.773 63.2HPLC法0.786 32.7190201A04Ag-Cu@rGO/GCE0.780 33.3HPLC法0.786 43.0190201A05Ag-Cu@rGO/GCE0.779 14.2HPLC法0.785 11.4

3 討論

3.1 化學修飾電極的選擇

本研究分別比較了阿魏酸在GCE、Ag-Cu/GCE、rGO/GCE、Ag-Cu@rGO/GCE電極上的差分脈沖伏安曲線，結果見圖3。可見，阿魏酸在Ag-Cu@rGO/GCE上的還原峰峰電流值最大，并且峰形也更好。因此，本研究選用Ag-Cu@rGO/GCE電極。

a. GCE; b.Ag-Cu/GCE; c.rGO/GCE; d.Ag-Cu@rGO/GCE。

圖31.03×10-4mol/L阿魏酸在不同電極上的差分脈沖伏安圖

Figure3Differential pulse voltamogram of 1.03×10-4mol/L ferulic acid at different electrodes

3.2 pH的選擇

本研究考察了不同pH值對阿魏酸電化學行為的影響，結果顯示，當pH小于5.96時，峰電流隨著pH的增大不斷增大，并在pH=5.04處達到最大值，之后隨著pH的增大不斷減小。另外，在堿性的環境中阿魏酸無法獲得較好的還原峰，故選擇pH 5.96的B-R緩沖溶液為測定阿魏酸的底液。

在Ag-Cu@rGO/GCE電極上，阿魏酸的還原峰電位(Epc)與pH值成線性關系，線性方程為Epc=-0.052 8pH+0.566 8，r=0.994 1。該方程的斜率-0.052 8，接近理論值-0.059，說明阿魏酸的電化學還原反應是等質子等電子的反應。

3.3 掃描速度的選擇

本研究考察了掃描速度對阿魏酸電化學行為的影響，結果顯示，隨著掃描速度的增加，還原峰峰電流也隨之增大，且電位負移；但掃描電壓過高時，充電電流過大，還原峰峰形變差，不利于峰電流的測定。在獲得較大峰電流同時又要防止充電電流過大，故選擇掃描電壓為0.1 V/s。

在Ag-Cu@rGO/GCE電極上，阿魏酸的還原峰電流(Ipc)與掃描速度(ν)的線性方程為：Ipc= -134.61ν+2.111 2(r=0.996 4)，表明阿魏酸在修飾電極表面的還原過程受吸附控制。根據Laviron方程[18]可計算轉移電子數n=1.86，說明阿魏酸在修飾電極上的電化學還原為雙電子雙質子過程。

3.4 Ag-Cu@rGO/GCE法與HPLC法的比較

修飾電極由于具有更高的靈敏度和選擇性，在中藥成分的電化學分析中用途廣泛。本文所建立的阿魏酸電化學測定方法與HPLC法[17]比較，在回收率及質量分數測定結果方面的差異均不顯著，且滿足中藥成分分析的要求，表明本方法可用于當歸中阿魏酸的測定。

本研究制備的Ag-Cu@rGO/GCE電極對阿魏酸有較好的選擇性和穩定性，但也還存在線性范圍不夠寬、檢測限不夠低等問題，在后續的研究中應對電極進一步優化，改善電極的性能缺陷，以便更好地適應中藥復雜成分中目標物的測定。