復(fù)方赤靈芝營(yíng)養(yǎng)粉對(duì)小鼠抗疲勞作用和氧化損傷模型小鼠的影響

林偉龍，李兆安，蔡金艷

(1.廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2.爽樂(lè)健康科技(中國(guó))有限公司，廣東 廣州 510006)

靈芝種類(lèi)繁多，其中藥用價(jià)值最高是紫靈芝，赤靈芝次之。現(xiàn)代分析研究顯示靈芝中主要活性成分有多糖類(lèi)、生物堿、氨基酸、三萜類(lèi)化合物以及微量元素等[1-2]。靈芝在我國(guó)應(yīng)用歷史悠久，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)靈芝能延緩疲勞，抗氧化功效顯著[3]。本研究以赤靈芝為主要原料并與具有滋補(bǔ)功能的藥材打粉混合制成的營(yíng)養(yǎng)粉為研究對(duì)象，通過(guò)運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)以及氧化損傷模型來(lái)考察該營(yíng)養(yǎng)粉的抗疲勞、抗氧化功效，為進(jìn)一步深入開(kāi)發(fā)赤靈芝保健產(chǎn)品提供實(shí)驗(yàn)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SPF級(jí)昆明小鼠80只，體質(zhì)量15～18 g，購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(粵)2013-0002。

1.2 藥物及試劑

復(fù)方赤芝營(yíng)養(yǎng)粉由爽樂(lè)健康科技(中國(guó))有限公司提供，每100 g中含有：赤芝50 g，菟絲子2 g，枸杞子2 g，五味子2 g，黃精2 g，桑葚2 g，油菜花粉20 g及羊奶粉20 g，產(chǎn)品的化學(xué)及微生物測(cè)試結(jié)果均符合食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)；生理鹽水(上海信裕生物科技有限公司)；溴代苯油、肝素鈉(上海麥克林生化科技有限公司)；MDA含量試劑盒(批號(hào)：20170725)、GSH-Px活性試劑盒(批號(hào)：20170725)、SOD活性試劑盒(批號(hào)：20170725)、BCA蛋白含量試劑盒(批號(hào)：20170725)，南京建成生物工程研究所。

1.3 主要儀器

全波長(zhǎng)掃描酶標(biāo)儀(Multiskan GO，美國(guó)賽默飛世爾公司)；JXFSTPRP-32勻漿儀(上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司)；H1650R離心機(jī)(湖南湘儀儀器有限公司)；Secura213電子天平(北京賽利多斯)。

1.4 樣品處理及溶液配制

稱(chēng)取營(yíng)養(yǎng)粉1 kg，加6 L去離子水，攪拌均勻，超聲60 ℃水浴浸提6 h，每次6 L去離子水相同條件下進(jìn)行浸提，反復(fù)浸提3次，浸提液體經(jīng)濃縮得稠浸膏490.1 g，密封冷藏備用。

1.5 方法

1.5.1 抗疲勞功效實(shí)驗(yàn)

1.5.1.1 動(dòng)物分組 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，隨機(jī)抽取39只小鼠分為3組：正常對(duì)照組、營(yíng)養(yǎng)粉低劑量組和營(yíng)養(yǎng)粉高劑量組，每組13只。各組每日自由攝食飲水，每日灌胃1次，低、高劑量組灌胃劑量分別為3 g/(kg·d)、9 g/(kg·d)，正常對(duì)照組每日灌胃等量生理鹽水。連續(xù)灌胃30 d。

1.5.1.2 抗疲勞實(shí)驗(yàn)方法 第30天給藥1 h后，進(jìn)行爬桿實(shí)驗(yàn)。將小鼠置于光滑玻璃棒的頂端，從實(shí)驗(yàn)開(kāi)始到小鼠無(wú)力支撐從玻璃棒上掉落的時(shí)間記為小鼠的爬桿時(shí)間，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后繼續(xù)飼養(yǎng)。第31天給藥1 h后，對(duì)3組小鼠進(jìn)行用時(shí)1 h的游泳適應(yīng)性訓(xùn)練，淘汰不適應(yīng)游泳的小鼠，確定每組10只共30只小鼠進(jìn)行負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)，繼續(xù)飼養(yǎng)給藥。第37天給藥1 h后進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)操作參照胡遠(yuǎn)等[4]的報(bào)道，實(shí)驗(yàn)前所有小鼠稱(chēng)質(zhì)量，每只小鼠的尾巴根部卷上重量為其自身體質(zhì)量5%的鉛皮，置于水溫為(23±1) ℃，水深為30 cm的水桶中進(jìn)行游泳實(shí)驗(yàn)，小鼠從開(kāi)始游泳到力竭(小鼠沉入水下10 s仍不能沖上水面)的時(shí)間記為小鼠的負(fù)重游泳時(shí)間。

1.5.2 抗氧化功效實(shí)驗(yàn)

1.5.2.1 動(dòng)物分組 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，隨機(jī)抽取40只小鼠分為4組：正常對(duì)照組、氧化模型組、營(yíng)養(yǎng)粉低劑量組和營(yíng)養(yǎng)粉高劑量組，每組10只。飼養(yǎng)條件及給藥方式和劑量同“1.5.1.1”，連續(xù)灌胃38 d。

1.5.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 第38天給藥1 h后，除正常對(duì)照組外，對(duì)其余3組小鼠進(jìn)行氧化損傷造模。造模操作參照蘇德奇等[5]的報(bào)道，所有小鼠禁食過(guò)夜，次日末次給藥后1 h，除正常對(duì)照組外均給予0.40 mg/kg溴代苯油，灌胃量0.2 mL/kg。22 h后稱(chēng)重記錄，摘眼球取血并處死小鼠，迅速取肝臟，置于預(yù)冷的生理鹽水中洗凈，濾紙吸干后稱(chēng)重記錄。取0.15 g組織放入2 mL EP管中，用眼科剪剪碎后按m∶v=1∶9的比例加入冰生理鹽水1.35 mL，勻漿后離心(3 000 r/min，10 min)，取上清液得到10%肝勻漿，按后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要分裝為4管，-20 ℃冰凍備用。

1.5.2.3 試劑盒操作 肝組織中蛋白濃度測(cè)定運(yùn)用BCA法測(cè)定，血漿和10%肝勻漿中的MDA含量、SOD活力和GSH-PX活力的測(cè)定，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方赤芝營(yíng)養(yǎng)粉的抗疲勞作用

由表1可知，與正常對(duì)照組對(duì)比，營(yíng)養(yǎng)粉高、低劑量組的爬桿時(shí)間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，爬桿時(shí)間明顯延長(zhǎng)，負(fù)重游泳時(shí)間均有延長(zhǎng)，高劑量組的負(fù)重游泳時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 復(fù)方赤芝營(yíng)養(yǎng)粉的抗氧化作用

2.2.1 復(fù)方赤芝營(yíng)養(yǎng)粉對(duì)肝勻漿中MDA含量、SOD活性和GSH-Px活性的影響 由表2可知，與正常對(duì)照組對(duì)比，模型組小鼠的MDA含量和SOD活性差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而GSH-Px活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示溴代苯誘導(dǎo)氧化損傷造模成功；與模型組比較，低劑量組與高劑量組的MDA含量均有所減少，其中低劑量組的MDA含量比高劑量的要低，低劑量組MDA含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，低劑量組和高劑量組SOD和GSH-Px的活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2.2 復(fù)方赤芝營(yíng)養(yǎng)粉對(duì)血漿中MDA含量、SOD活性和GSH-Px活性的影響 由表3可知，與正常對(duì)照組對(duì)比，模型組MDA含量、SOD活性差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，GSH-Px活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，低、高劑量組MDA含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)，且低劑量組MDA含量比高劑量組含量低；高、低劑量組的SOD活性和高劑量GSH-Px活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 復(fù)方赤芝營(yíng)養(yǎng)粉對(duì)小鼠爬桿時(shí)間和負(fù)重游泳時(shí)間的影響Table 1 Effect of compound Ganoderma lucidum powder on the climbing time and swimming time in mice

與正常對(duì)照組比較：**P<0.01。

表2復(fù)方赤靈芝營(yíng)養(yǎng)粉對(duì)氧化損傷小鼠肝勻漿MDA含量和SOD及GSH-Px活性的影響

與正常對(duì)照組比較：**P<0.01； 與模型組比較：△△P<0.01。

表3復(fù)方赤芝營(yíng)養(yǎng)粉對(duì)氧化損傷小鼠血漿MDA含量和SOD及GSH-Px活性的影響

組別劑量/(g·kg-1)nc(MDA)/(mmol·L-1)SOD/(U·mL-1)nGSH-Px/(U·mL-1)正常對(duì)照組-109.78±1.6699.62±16.969355.30±24.86模型組-1010.46±1.3999.71±27.517319.07±31.54?赤芝營(yíng)養(yǎng)粉 低劑量組3107.64±0.71△△97.26±25.056310.14±36.58高劑量組9108.29±1.42△101.20±35.389328.49±20.64

與正常對(duì)照組比較：*P<0.05； 與模型組比較：△P<0.05，△△P<0.01。

3 討論

疲勞在中醫(yī)學(xué)中解釋為“虛勞”，是生物體日常活動(dòng)后產(chǎn)生的正常現(xiàn)象，即運(yùn)動(dòng)性疲勞。長(zhǎng)期的運(yùn)動(dòng)性疲勞可能會(huì)影響機(jī)體正常功能甚至產(chǎn)生損傷。從傳統(tǒng)中醫(yī)理論的角度看，復(fù)方赤芝營(yíng)養(yǎng)粉中赤芝、黃精、五味子補(bǔ)腎氣，養(yǎng)陰生津；菟絲子、枸杞子滋補(bǔ)肝腎；桑葚補(bǔ)血滋陰、生津潤(rùn)燥；油菜花粉補(bǔ)腎固本；羊奶粉補(bǔ)腎虛、益精氣。前有學(xué)者[6-8]研究表明，菟絲子、黃精、五味子等對(duì)小鼠有明顯的抗疲勞作用。本研究結(jié)果也顯示復(fù)方赤芝營(yíng)養(yǎng)粉能夠延長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)時(shí)間，且呈劑量依賴(lài)性，說(shuō)明該營(yíng)養(yǎng)粉可增強(qiáng)小鼠體質(zhì)，延緩疲勞，增強(qiáng)體力。

脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA會(huì)對(duì)細(xì)胞膜造成功能性損傷，導(dǎo)致機(jī)體衰老甚至引發(fā)疾病，其含量反映機(jī)體脂質(zhì)的過(guò)氧化水平。體內(nèi)重要的抗氧化酶如SOD和GSH-Px在保護(hù)機(jī)體清除過(guò)氧化產(chǎn)物和自由基的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，抗氧化能力是反映機(jī)體抗衰老能力的重要指標(biāo)[9-10]。本實(shí)驗(yàn)所采用的溴代苯氧化模型是保健食品功能評(píng)價(jià)常用的模型之一，溴代苯使細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化從而引起肝細(xì)胞氧化損傷。以往的研究表明，赤靈芝多糖能夠提高免疫抑制小鼠的抗氧化能力，降低小鼠體內(nèi)MDA的含量[11-12]；五味子多糖能夠提高小鼠的SOD活性并且降低MDA含量[13]；黃精多糖對(duì)心肌肥厚大鼠具有很好的體內(nèi)抗氧化作用[14]。本研究結(jié)果中，營(yíng)養(yǎng)粉低劑量組小鼠體內(nèi)MDA的含量對(duì)比模型組明顯下降，高劑量組小鼠體內(nèi)MDA含量雖有下降但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；SOD以及GSH-Px的活性對(duì)比模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明復(fù)方赤靈芝營(yíng)養(yǎng)粉具有一定的抗氧化功效，且服用低劑量的復(fù)方赤靈芝營(yíng)養(yǎng)粉更能有效地減少機(jī)體過(guò)氧化產(chǎn)物，但對(duì)于抗氧化酶活性的影響及機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。