基于斑馬魚胚胎模型的抗腫瘤藥物毒性評價方法

程祖春，趙海山,馮啟榮,孫婷偉,譚文

(1.廣東工業大學輕工化工學院，廣東 廣州 510006； 2.廣東工業大學生物醫藥研究院，廣東 廣州 510006)

抗腫瘤藥物(anti-tumor drug)在殺傷腫瘤細胞的同時也對機體正常細胞造成損害，因此導致顯著的毒副作用。毒副作用主要表現為：心臟、肝臟、腎臟毒性，骨髓抑制及胃腸道黏膜受損等，其中心臟毒性是最主要的因素，是限制其廣泛使用的主要原因[1]。藥物從設計合成到臨床使用的整個研究階段，毒副作用是藥物研發失敗的主要因素。即便是上市后仍有許多藥物因為明顯的心血管毒性被撤出市場或嚴格限制使用。

目前已有多類抗腫瘤藥物被證明具有顯著的心臟毒性。比如，以阿霉素(Doxorubicin，Dox)為代表的蒽環類抗腫瘤藥物，在臨床應用上發現其會引起嚴重的心臟毒性，這種心臟毒性與藥物累計用量相關，常導致化療療程被迫中斷，嚴重時會導致嚴重心力衰竭并死亡[2-5]。此外，多種多靶點酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)類藥物也存在嚴重的心臟毒性，如蘇尼替尼(Sunitinib，Sun)與索拉非尼(Sorafenib，Sor)，它們通過抑制PDGFR及VEGFR等酪氨酸激酶受體，抑制腫瘤血管新生而起到抗腫瘤作用。但同時也導致嚴重的心血管毒性，包括高血壓、心衰、心律失常、急性冠狀動脈綜合征和心肌梗死等[6-11]。

因此，對抗腫瘤藥物的心血管毒性進行快速、準確的高通量篩選與安全性評價，是減少臨床心血管毒副作用的重要手段，同時為臨床用藥提供理論基礎。目前，藥物安全性評價模型主要有體內和體外2大類型。一類是以細胞為代表的體外模型，雖可進行高通量篩選，但不能模擬動物的整體生理過程；第二是以小鼠為代表體內模型，可從整體評價藥物的毒性作用，但受到周期、費用、法律等諸多因素限制。因此，尋找一種快速、高效、直觀可進行活體監測的藥物毒性評價模型成為迫切需求。

斑馬魚(zebrafish)作為整體動物模型，它具有產卵多、體外受精發育、胚胎透明等優點[12]，便于活體觀測心血管系統的表型改變。已經成為繼小鼠之后藥物毒性評價的重要模式生物，尤其在心血管研究領域，有非常成熟和廣泛的應用[13]。Liu等[14]使用Dox誘導的斑馬魚胚胎心臟毒性模型，從3 000個化合物中篩選出2個(VIS和DPU)具有明顯改善Dox心臟毒性的化合物。Sarathd等[15]使用MPTP在斑馬魚胚上誘導帕金森疾病模型，用于篩選具有潛在治療帕金森疾病的化合物。Cao等[16]在斑馬魚胚胎上評估福美鋅(ziram)對胚胎發育的影響，通過評價存活率、心率、胚胎形態、行為、分子等方面進行評價。Jin等[17]使用Tg[flk:EGFP]品系斑馬魚建立腫瘤異種移植模型來評價抗腫瘤藥貝伐單抗、恩度和阿帕替尼的功效、安全性和腫瘤抑制作用。

因此，本研究選用Tg[myl7:EGFP]和Tg[flk:EGFP]轉基因系斑馬魚作為研究對象，建立了抗腫瘤藥物心臟毒性的評價體系，評價了Dox、Sun、Sor 3種抗腫瘤藥物對斑馬魚胚胎的急性毒性、心臟毒性、心血管發育等影響，一方面為未來的進一步新藥開發提供資料及線索，也為其他類型抗腫瘤藥物毒性評價提供了可靠的模型。

1 儀器與材料

Stemi 508型體視顯微鏡(德國Carl Zeiss公司)；Axio Imager.2型熒光正置顯微鏡(德國Carl Zeiss公司)；Axio Observer A1型熒光倒置顯微鏡(德國Carl Zeiss公司)；DHP-9012型恒溫培養箱(上海一恒科學儀器有限公司)。

Doxorubicin HCl原料藥(Selleck chem，批號：S120813，質量分數99.82%)；Sorafenib(Selleck chem，批號：S739707，質量分數99.89%)；Sunitinib malate原料藥(Selleck chem，批號：S104207，質量分數99.63%)。

Holt buffer 配制如下：量取1 900 mL ddH2O，置于2 L燒杯中，使用攪拌器攪拌，依次加入：7.000 g NaCl，0.400 g NaHCO3，0.100 g KCl和0.235 g CaCl2，ddH2O定容至2 000 mL，并使用一次性真空過濾器(孔徑0.22 μmol/L)過濾，常溫儲存備用。

實驗所用魚品種為Tg[myl7:EGFP]或Tg[flk:EGFP]成年魚齡為6個月～12個月，魚系均購于國家斑馬魚資源中心。

2 方法

2.1 溶液的制備

Dox用ddH2O溶解，制備成1 mmol/L的儲備液，分裝于1.5 mL EP管中，避光置于-20 ℃冰箱。

Sor、Sun用DMSO溶解，分別制備成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mmol/L儲備液，并分裝于1.5 mL EP管中，避光置于-20 ℃冰箱。

2.2 斑馬魚胚胎的獲取

在實驗前1天下午喂食1 h后，選取健康的成年魚系，雌雄各半，置配種缸中，每缸1對，并用隔板將雌雄隔開。次日上午9:00，打開隔板，自由交配后1 h后收集胚胎，挑選發育正常受精卵于培養皿中，加入適量Holt buffer培養液，每皿不超過100枚胚胎，置于28 ℃恒溫培養箱中培養。

2.3 斑馬魚胚胎的急性毒性

取24hpf(受精后小時)的AB系野生型斑馬魚胚胎，分成若干組，置于96孔板中，每孔1枚，每組20孔。用Holt buffer培養液按體積比稀釋成不同濃度的Dox溶液，使終濃度分別為0、20、40、50、60、70、80 μmol/L。

同時，Holt buffer培養液按體積比稀釋成不同濃度的Sor、Sun溶液，使終濃度分別為0、5、10、15、20、25、30 μmol/L。并設置1%DMSO溶劑對照組，每孔加入100 μL，24 h后再加入100 μL藥液。將96孔板置于28 ℃恒溫配養箱中培養，每天于倒置顯微鏡下觀察并記錄胚胎的存活狀況，以胚胎心臟停止跳動或者卵凝結為死亡判定標準。最后，統計藥物處理24、48、72 h的胚胎存活率，并作存活率曲線，計算LC50值。實驗重復4次。

2.4 斑馬魚胚胎心臟功能的評價

為評價抗腫瘤藥物對胚胎的整體毒性，選擇胚胎藥物暴露處理48 h(即72hpf)。取24hpf(受精后)的Tg[myl7:EGFP]轉基因魚系胚胎60枚，分成18組，每組15枚，置于24孔板中。用Holt buffer培養液分別將Dox、Sor、Sun稀釋至5、10、15 μmol/L。藥物處理48 h后，即72hpf時，用Holt buffer胚胎培養液洗清洗3次，以去除藥液。在凹面載玻片上滴加1滴3%的甲基纖維素固定溶液，以固定胚胎。然后將胚胎置于固定液上，于體式顯微鏡下并調整好胚胎的位置，將兩眼保持重合，身體保持平直。在10×正置熒光顯微鏡下，選用EGFP通道找到心臟位置，計數15 s心跳次數，最后×4計算每分鐘心率。

同時，使用錄像功能對胚胎心臟位置進行錄像，保存視頻。視頻使用Adobe Premiere視頻軟件逐幀播放，找到同一周期內心臟舒張和收縮時的那一幀，導出圖片。然后用Photoshop測量工具對舒張和收縮末期心室內徑進行測量，計算收縮分數(fractional shortening，FS)；并測量靜脈竇到動脈球之間的距離，以計算靜脈竇-動脈球(SV-BA)的間距。實驗每次選取10只進行數據統計，實驗重復3次。

2.5 斑馬魚胚胎血管發育的評價

為評價抗腫瘤藥物對胚胎血管發育的影響，選擇胚胎藥物暴露處理48 h(即72hpf)。取24hpf(受精后小時)的Tg[flk:EGFP]轉基因魚系胚胎60枚，分成4組，每組15枚，置于24孔板中。用Holt buffer培養液分別將Dox、Sor、Sun稀釋至5 μmol/L。藥物處理48 h后，即72hpf時，用Holt buffer胚胎培養液洗清洗3次，以去處藥液。在凹面載玻片上滴加一滴3%的甲基纖維素固定溶液，以固定胚胎。然后將胚胎置于固定液上，于體式顯微鏡下并調整好胚胎的位置，將兩眼保持重合，身體保持平直。最后，將玻片置于5×正置熒光顯微鏡下，選用EGFP通道對胚胎進行拍照，每組選取5～8只。

2.6 統計學方法

3 結果

3.1 胚胎急性毒性

結果表明，DMSO溶劑組對胚胎存活率無明顯影響。胚胎經不同濃度的Dox、Sor、Sun處理24 h后(即48hpf)，其存活數量與對照組比較無明顯改變；處理48 h后(即72hpf)后，Dox組存活率與對照組比較無明顯改變，而Sor與Sun處理組存活率開始明顯下降；處理72 h后(即96hpf)，各組胚胎均有明顯的死亡，胚胎存活率隨著Dox、Sor、Sun濃度的增加而顯著降低，呈現出明顯的濃度依賴性(圖1B-D)。3種抗腫瘤藥物Dox、Sor、Sun對96hpf胚胎的LC50值分別為51.56、12.98、19.10 μmol/L(表1)。由此，比較出3種抗腫瘤藥對斑馬魚胚胎毒性的順序為：Sor>Sun>Dox。

3.2 斑馬魚胚胎的整體毒性

對照組胚胎發育正常，脫膜孵化為幼魚，心臟呈S形，側面觀察心室和心房部分重疊，心血管系統無形態學改變(圖2A)。5 μmol/L Dox處理組胚胎發育基本正常，體節間血流循環正常，卵黃略有縮小，無可見心血管系統形態學改變；10 μmol/L Dox處理組胚胎出現輕微心包膜水腫，血流緩慢、心臟輕微畸形；15 μmol/L Dox處理組胚胎血流緩慢或者無背部血流，卵黃囊出血、并有明顯凹陷，房室瓣受損、血液返流，心臟功能受阻(圖2B)。

A.胚胎處理方法； B.Dox組； C.Sor組； D.Sun組。

圖13種抗腫瘤藥物對48hpf、72hpf、96hpf胚胎存活率的影響

Figure1Effect of three anti-tumor drugs on the survival rate of 48hpf,72hpf and 96hpf embryos

表196hpf斑馬魚胚胎急性毒性LC50值

Table1Acute toxicity LC50value of 96hpf zebrafish embryo

組別LC50/(μmol·L-1)95%置信區間/(μmol·L-1)Dox51.5642.49～62.58Sor12.989.72～17.35Sun19.1015.88～23.05

5 μmol/L Sor處理組胚胎出現明顯的心包水腫，卵黃囊變小，心臟畸形且線性化、心室變小、體節間血流緩慢或無血液循環等多種形態改變；隨著濃度的增加，胚胎整體毒性越顯著，10 μmol/L Sor處理組胚胎呈現顯著心包水腫，卵黃囊明顯凹陷，心臟嚴重畸形且線性化、心房與心室變小、血流緩慢或無血液循環等多種形態改變；15 μmol/L Sor時，胚胎心包囊腫，卵黃囊凹陷變小，體長縮短、體節發育異常、脊柱彎曲，短尾卷曲，心臟畸形，體節間血管無血液循環，胚胎生長發育受到嚴重影響(圖2C)。

5 μmol/L Sun處理組出現輕微心包水腫，體節間血流緩慢，卵黃囊出血并有明顯凹陷；隨著濃度的增加，胚胎整體毒性越顯著，10 μmol/L Sun時出現明顯的心包水腫，心臟畸形且線性化、心室變小、體節間無血液循環等；當濃度為15 μmol/L Sun時，胚胎整體出現多種形態學的改變，卵黃囊水腫、出血，心臟線性化，房室瓣缺損、無血流循環，體長縮短、體節發育異常、脊柱彎曲等(圖2D)。

A. Control組； B. Dox組； C. Sor組； D. Sun組。

圖2不同濃度的Dox、Sor、Sun對72hpf胚胎整體發育的影響

Figure2Effect of different concentrations of Dox,Sor and Sun on the overall development of 72hpf embryos

3.3 斑馬魚胚胎的心臟毒性

為評價抗腫瘤藥物對斑馬魚胚胎心功能的影響，本部分實驗心臟特異性表達綠色熒光蛋白的Tg[myl7：EGFP]轉基因斑馬魚系，對胚胎整體毒性及心臟毒性進行直觀可靠的評價。

斑馬魚胚胎分別經不同濃度的Dox、Sor、Sun處理48 h，到達實驗終點時，用Holt buffer洗去藥液，并于正置熒光顯微鏡下計數胚胎心跳次數。顯微鏡選取EGFP通道，對胚胎進行拍照和心臟位置錄像。并用Photoshop測量心室舒張和收縮末期短軸內徑，以計算FS。

胚胎在暴露于3種不同濃度抗腫瘤藥物48 h后，心臟結構線性化，心室縮短分數(FS)、心率和體長顯著降低(圖3B-G)。對照組心臟結構物明顯改變(圖3A)。對照組72hpf胚胎心房、心室跳動規則，心室收縮分數為(22.53±3.14)%、心率平均為(96.6±13.8)次/分。隨著Dox、Sor、Sun濃度的升高，胚胎收縮功能和心率顯著降低，呈現明顯劑量效應關系。

Dox各濃度處理組FS分別為：(16.31±3.26)%、(14.89±3.49)%、(11.03±2.72)%；Sor各濃度處理組FS分別為：(10.72±3.48)%、(8.33±2.19)%、(7.15±3.38)%；Sun各濃度處理組FS分別為：(13.17±3.02)%、(8.54±2.36)%、(5.86±2.74)%(圖3E、F)。與對照組相比，差異具有高度統計學意義。

Dox各濃度處理組心率分別為：(79.2±10.8)、(67.2±18.96)、(58.2±16.56)次/分；Sor各濃度處理組心率心率分別為：(48±15.6)、(41.4±12.72)、(28.8±6.24)次/分；Sun各濃度處理組心率分別為：(67.2±9.6)、(58.2±17.17)、(46.8±15.6)次/分(圖3E、F)。與對照組相比，差異具有高度統計學意義。

Dox個濃度處理組對SV-BA間距無顯著影響；Sor各處理組SV-BA顯著增加(P<0.001)；而Sun 5 μmol/L處理組隊SV-BA無影響，當濃度為10 μmol/L 和15 μmol/L 時，SV-BA間距變長(P<0.05)。

綜上，3種抗腫瘤藥物對胚胎毒性的強弱順序為：Sor>Sun>Dox。

3.4 斑馬魚胚胎的血管發育的影響

為評價抗腫瘤藥物對斑馬魚胚胎血管發育的影響，采用血管特異性表達綠色熒光蛋白的Tg[flk:EGFP]轉基因斑馬魚系。斑馬魚胚胎分別經5 μmol/L Dox、Sor、Sun處理48 h，到達實驗終點時，用Holt buffer洗去藥液，于正置熒光顯微鏡下對胚胎拍照。

結果如圖4所示。對照組胚胎血管發育正常，可觀察到發育正常的血管結構。體節間血管(intersgmental blood vessels,ISVs)從背部主動脈側(dorsal aorta,DA)或后主靜脈(postrrior cardinal vein,PCVs)延伸到縱向背側吻合血管(dorsal longitudinal anastomotic vessels,DLAVS)(圖4A)。5 μmol/L Dox處理組對血管發育有輕微的損傷，表現為體節間血管變細，內皮細胞受損(圖4B箭頭)。Sor處理組對血管發育有明顯的抑制，表現為ISV和DLAV完全被抑制，背部主動脈血管受損便薄，體節間未可見血管生成。同時，胚胎頭部血管明顯減少(圖4C)。Sun處理同樣表現出明顯的抑制作用，體節間只有少數血管生成，未見DLAV生成。同時，胚胎頭部血管明顯減少(圖4D)。

A. Control組； B. Dox組； C. Sor組； D. Sun組； E. FS； F.心率； G.SV-BA間距。與Control組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

圖3不同濃度的Dox、Sor、Sun對72hpf胚胎心臟功能的影響

Figure3Effect of different concentrations of Dox,Sor and Sun on the contractile function of 72hpf embryos

A. Control 組； B. 5 μmol/L Dox組； C. 5 μmol/L Sor組； D. 5 μmol/L Sun組。

圖4Dox、Sor、Sun對胚胎血管發育的影響

Figure4Effect of Dox,Sor and Sun on embryonic vascular development

4 討論

心血管毒性是抗腫瘤藥物最常見的不良反應，也是限制抗腫瘤藥物廣泛使用的主要因素。然而，長期以來缺乏快速、高效、直觀的整體動物毒性評價模型。因此，尋找一種兼具體內和體外模型優點，又可快速進行高通量篩選藥物心血管毒性的模型成為毒理學研究的熱點之一。

斑馬魚作為整體動物模型，具有體外受精發育、產卵量高、周期短、操作簡便的優點，可實現對藥物毒性的高通量篩選評價[18]。而其胚胎期全身透明，因此在顯微鏡下可直接觀察心血管系統的形態變化，以評價藥物對各個組織器官的毒性。同時，斑馬魚有非常多熒光標記的轉基因魚系，可對組織器官進行熒光標記，有利于顯微鏡成像，更加直觀便捷地對胚胎的組織器官發育進行評價[19-20]。

本研究選擇了蒽環類抗腫瘤藥物中的代表Dox，以及TKIs類的Sun及Sor進行研究。其中，Dox的抗腫瘤機制表現：第一，Dox干擾轉錄過程，通過插入到DNA堿基鏈中，抑制RNA的生成，而阻斷DNA的復制，屬于細胞周期非特異性藥物[21]；第二，Dox同時也抑制DNA拓撲異構酶Ⅱ(TOP2)，觸發腫瘤細胞凋亡，在快速增值和高表達TOP2的細胞中最有效[22]。但是，Dox也同樣造成心肌細胞DNA損傷，增加氧化壓力，誘導炎癥，導致心肌細胞凋亡，嚴重可造成心衰及死亡，最終限制了其在臨床上的廣泛使用[23-24]。

以Sun及Sor為代表的TKIs類抗腫瘤藥物，通過抑制血管內皮生長因子受體(VEGFR)和血小板衍生生長因子受體(PDGFR)參與腫瘤細胞的增殖和血管生成，從而起到對腫瘤細胞的殺傷作用[25-28]。Sun可引起左心室射血分數降低和充血性心力衰竭(congestive heart failure,CFH)，兩種情況的發生率分別為11%和8%。Sor可引起缺血性心臟病，其中包括心肌梗死(發生率約3%)[29]。Sun和Sor均可導致心房血栓和高血壓的發生風險增高[30]。

本研究結果表明：在急性毒性方面，3種抗腫瘤藥物均明顯降低了胚胎的存活率。Dox、Sor、Sun對96hpf胚胎的LC50值分別為51.56、12.98、19.10 μmol/L。在心血管毒性方面：抗腫瘤藥物處理的胚胎出現嚴重的心包水腫、心臟畸形且線性化、心室變小、卵黃囊明顯凹陷，體長縮短、體節發育異常、脊柱彎曲、短尾卷曲、體節間血流緩慢或無血液循環等多種形態改變。隨著濃度的身高，胚胎心率、心臟FS顯著降低，心臟功能嚴重受損，同時SV-BA間距變長。

在血管發育方面：對照組胚胎血管發育正常，可觀察到發育正常的血管結構。Dox處理組未對血管發育產生明顯影響，這與Dox抗腫瘤作用機制吻合；而Sor和Sun均明顯抑制血管生成，與其通過抑制VEGF/VEGFR通路參與腫瘤細胞的增殖和血管生成的機制吻合。

綜上所述，可見Sor及Sun的LC50顯著低于Dox。而在相同劑量濃度下，Sor及Sun對心臟功能及結構的影響均大于Dox，而Sor的毒性較Sun更為明顯。這些結果表明了Sor及Sun的心臟毒性較Dox更強。由于目前臨床上對Sor及Sun的毒副作用的關注主要集中在消化系統的不良反應上，本研究結果提示，在臨床上可能需要更進一步重視這類藥物潛在的心血管疾病風險。