HDAC抑制劑N2E誘導人肝星狀細胞LX-2凋亡作用的研究

王曉翔，岑梓文，馮冰虹

(廣東藥科大學藥學院，廣東 廣州 510006)

肝病為危害人類健康的危險因素之一，全球每年有超過100萬人死于病毒性肝炎[1]，許多急性肝炎患者和肝炎病毒攜帶者可轉變為慢性肝炎患者，慢性肝炎部分可發展為肝硬化，最終導致肝癌，我國肝癌的發病率約占全球肝癌死亡人數的40%，已經成為我國面臨的嚴重公共衛生問題之一[2-3]。肝纖維化(hepatic fibrosis)是由多種原因引起的慢性肝損傷的常見結果，是肝臟對一系列慢性刺激損傷修復的病理反應，以細胞外基質過度沉積為主要特征[4]。目前為止，仍然未出現獲得臨床批準使用的抗纖維化的藥物，因此研制有效的抗纖維化藥物是現今研究的熱點[5]。人肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)的激活與增殖是肝纖維化形成的核心環節，HSCs的激活機制及抑制活化途徑的研究已成為防治肝纖維化的關鍵。目前國際上抗肝纖維化藥物研發的思路是從肝纖維化發生機制中尋找靶點，由于HSC激活是多個信號傳導途徑協調的結果，其復雜性和未知因素導致阻斷模式的特異性和多樣性。新近研究進展表明，表觀遺傳學的異常調控可能是肝纖維化發病機制和發展的主要驅動力[6]，主要表現為由組蛋白乙酰化(histone acetylation)所參與的調節HSCs的活化增殖環節，并提出組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)可能是具有較高潛在應用價值的特異性靶標[7-8]。

伏立諾他(vorinostat，SAHA)為首個被美國FDA 批準上市的 HDAC抑制劑，屬于異羥肟酸類藥物，對博來霉素所誘導的特發性肺纖維化有顯著的修復作用[9]。

小分子化合物 N2E與SAHA 同屬異羥肟酸類，其化學名稱為N-(2-乙氧基苯基)-N′-羥基辛二酰胺，對HDAC的抑制效果比SAHA強2倍以上[10]。預實驗發現，小分子化合物 N2E有良好的抗肝纖維化作用，可逆轉纖維化，減少肝臟損害。本研究旨在進一步探討N2E誘導人肝星狀細胞LX-2細胞凋亡作用，初步明確其抗肝纖維化的可能性。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

人肝星狀細胞LX-2由廣東藥科大學蘭天博士肝纖維化研究小組提供。N2E通過特殊方法合成[10]。SAHA(大連美倫生物科技公司)；細胞周期試劑盒、AnnexinV-APC/PI 試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司)；線粒體膜電位檢測試劑盒、Caspase-3分光光度計法檢測試劑盒(碧云天生物技術有限公司)；HDAC3一抗(1∶4 000，Abcam)、Caspase-3一抗(1∶500)、α-SMA一抗(1∶500)、TGF-β1一抗(1 500)均購自萬類生物科技有限公司；DMEM培養基(Thermo公司)；胎牛血清(FBS，Gibico公司)；ECL化學發光液(Bio-Rad公司)。

1.2 主要儀器

SW-CJ-2F型凈化工作臺(蘇州凈化有限公司)；水套式CO2培養箱(Thermo公司)；光學顯微鏡(Nikon公司)；流式細胞儀(BD FACSCalibur公司)；SPD-M20A 分光光度計(日本島津公司)。

1.3 細胞流式檢測N2E作用LX2細胞的細胞周期

分別設置空白對照組，N2E(2.5、5、10 μmol/L)組，SAHA(10 μmol/L)組，給藥24 h后，離心采集細胞，棄上清，用預先冷卻的PBS洗滌細胞2次，加入預先冷卻的70%(體積分數,下同)乙醇重懸液，于4 ℃固定過夜，或-20 ℃長期固定。細胞染色，離心收集細胞，每次1 mL PBS洗滌細胞，加入 PBS[包括試劑盒中提供的5 μg/ mL碘化物C錠(PI)]500 μL，100 μg/mL RNaseA、0.2%Triton X-100)4 ℃避光孵育30 min。流式細胞儀分析：以標準程序用流式細胞儀檢測，一般計數1×105個細胞以上，結果用細胞周期擬合軟件Flowjo分析。

1.4 AnnexinV-APC/PI雙染法檢測N2E對LX-2細胞的凋亡作用

分別設置空白對照組、N2E(2.5、5、10 μmol/L)組，SAHA(10 μmol/L)組，給藥24 h后收集細胞，PBS洗滌1次，然后用1×結合緩沖液洗滌; 使用1×Binding緩沖細胞和計數，細胞數為5×106/mL; 收集細胞，分別加入膜聯蛋白V-APC、PI 各5 μL，室溫孵育15 min，加入1×Binding緩沖液重懸液400 μL 混勻，流式細胞儀檢測并分析數據。

1.5 MMP法檢測N2E對LX-2細胞凋亡作用

分別設置空白對照組、N2E(2.5、10 μmol/L)組、SAHA(10 μmol/L)組以及線粒體膜電位檢測試劑盒提供的陽性對照CCCP組。N2E、SAHA組處理24 h后，收集細胞上清以及細胞后離心，去上清，根據試劑盒說明書進行操作染色，通過流式細胞儀進行正常線粒體膜電位(MMP)的檢測。采用Flowjo軟件對數據進行分析處理，得到各組的細胞MMP變化特點。

1.6 分光光度計法檢測N2E作用LX-2后Caspase-3的活性

取試劑盒提供的標準品，根據說明繪制標準曲線(y=331.320 3x+0.242 3，R2=0.997 1)，分別設置空白對照組、N2E(2.5、10 μmol/L)組、SAHA(10 μmol/L)組，種皿給藥后，收集細胞并裂解。根據試劑盒說明書對樣品進行處理。最后將處理好的樣品放于波長450 nm處測定吸光度(A值)，根據標準曲線計算出N2E作用LX-2后Caspase-3的活性。

1.7 免疫蛋白印跡

將生長良好、密度合適的肝星狀細胞系LX-2細胞，培養24 h后，分別加入含2.5、5、10 μmol/L的N2E和10 μmol/L的SAHA，繼續培養24 h。N2E由無菌DMSO溶解后，配置成5 mmol/L濃度的母液。裂解液裂解后收集細胞至EP管中，4 ℃離心35 min(12 000 r/min)，取上清液進行細胞定量，將蛋白進行電泳以及轉膜，封閉液封閉1 h后，一抗和內參β-actin在4 ℃孵育過夜，次日二抗孵育45 min，采用增強化學發光液(ECL)發光顯影。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 細胞周期法檢測N2E對LX-2的凋亡誘導作用

利用 FlowJo V7.6.2軟件對N2E處理過的LX-2細胞進行不同時期的模擬分析 (圖1 A)。并根據G1、S、G2期細胞數占總數的百分比進行統計(圖1 C)。對比空白對照組，可以觀察到N2E組在G1期細胞占總數的百分比減少，且在高濃度較為明顯(對比低、中濃度，高濃度下降了17.08%)。而在S期，細胞占總數的百分比隨著藥物濃度的增加而逐漸增加(從低濃度的8.53%逐漸上升至高濃度的14.46%)，且呈現濃度依賴性。N2E組在細胞的G2/M期細胞占總數的百分比有一定提升，但變化不明顯，且沒有濃度依賴性。說明N2E可能是通過阻滯細胞于S期，使其DNA損傷，影響DNA的轉錄復制，來達到抑制LX-2細胞增殖的作用。這與陽性藥物SAHA組結果一致。

2.2 AnnexinV-APC/PI雙染法檢測N2E對LX-2的凋亡誘導作用

如圖1 B所示，空白對照組的成活率和細胞凋亡率分別在80%以上和20%以下。N2E或SAHA治療24 h后,觀察到明顯的細胞凋亡 (圖1 D)。在 2.5 μmol/L N2E的作用下,LX-2細胞的總凋亡率為23.32%；隨著濃度的增加，LX-2細胞的凋亡率增加；在10 μmol/L N2E作用下，LX-2細胞總凋亡率為63.22% (P<0.01)。結果表明N2E可顯著誘導人肝星狀細胞凋亡。

A. N2E對人肝星狀細胞LX-2細胞周期的影響； B. N2E對人肝星狀細胞LX-2凋亡率的影響； C. N2E對LX-2細胞周期的影響； D. N2E對人肝星狀細胞LX-2凋亡率的影響； E. N2E對人肝星狀細胞LX-2 MMP的影響； F.N2E對人肝星狀細胞LX-2 Caspase-3活性的影響；與空白對照組比較：*P<0.05,**P<0.01。

2.3 MMP法檢測N2E對LX-2的凋亡誘導作用

如圖1 E所示，N2E對人肝星狀細胞作用24 h，當濃度為2.5 μmol/L N2E時，MMP變化并不明顯，當濃度遞增至10 μmol/L時，可觀察到MMP較空白對照組以及低濃度組明顯下降(P<0.05)，此外SAHA的MMP變化與空白對照組對比沒有明顯變化，而CCCP陽性對照組則同高濃度N2E組一樣，表現出明顯的下降變化，保證了實驗的準確性。

2.4 Caspase-3分光光度計法檢測N2E對LX-2的凋亡誘導作用

如圖1 F所示，N2E作用LX-2細胞24 h后，其細胞的Caspase-3活性與對照組相比明顯增強；SAHA作用LX-2后，Caspase-3活性并無明顯的變化。而2個濃度的N2E均能顯著增加Caspase-3的活性(P<0.01)，提示N2E可能通過調控Caspase-3來誘導人肝星狀細胞LX-2凋亡。

2.5 N2E作用LX-2后對HDAC3、α-SMA、Caspase-3以及TGF-β1蛋白表達的影響

與對照組相比，3個濃度的N2E(2.5、5.0、10.0 μmol/L)均能顯著下調HDAC3、α-SMA、TGF-β1以及Caspase-3的表達水平，并促進Cleaved-Caspase-3蛋白的表達，差異具有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。同時，N2E對LX-2細胞中的TGF-β1表達也均有下調作用，與陽性藥SAHA實驗結果一致。見圖2。

3 討論

細胞周期(cell cycle)是指細胞從一次分裂開始到下一次分裂結束的整個過程，包括DNA合成相關的細胞間期(G1期、S期、G2期)以及細胞分裂期(M期)2個階段。細胞周期的檢測結果顯示N2E能阻滯LX-2細胞于S期，且呈現濃度依賴性，與陽性藥物SAHA組的結果一致。S期為細胞復制過程中1倍DNA到2倍DNA的階段，N2E阻滯LX-2細胞停滯在S期，可能是通過使其DNA損傷，影響DNA的轉錄復制，從而達到抑制LX-2細胞增殖的作用。結果提示N2E不但可以抑制細胞增殖，還能誘導細胞發生凋亡。肝星狀細胞在肝纖維化的發生以及發展過程中都起到了重要的作用，誘導肝星狀細胞凋亡也是抗肝纖維化的一種治療方式[11]。隨后通過流式細胞術定量檢測LX-2的細胞凋亡率，使用帶有熒光的APC標記的Annexin V-APC，選擇性地與細胞早期凋亡時出現細胞外翻至細胞膜外側的磷脂酰絲氨酸相結合，然后通過流式細胞儀檢測是否存在凋亡現象。結果顯示，隨著N2E的濃度遞增，細胞發生凋亡的比率顯著增加，表明N2E能誘導肝星狀細胞LX-2發生凋亡，且呈現濃度依賴性。

A. Western blot檢測N2E對LX-2中HDAC3、α-SMA、TGF-β1以及Caspase-3、Cleaved-Caspase3的蛋白表達影響； B.蛋白表達統計分析；與空白對照組比較：*P<0.05,**P<0.01。

圖2N2E對LX-2細胞中HDAC3以及相關蛋白的影響

MMP是維持細胞線粒體氧化磷酸化并產生三磷酸腺苷的先決條件，而MMP的穩定性是維持細胞正常生理功能的前提。 MMP下降是細胞早期凋亡的重要標志。通過檢測LX-2在N2E作用下MMP的變化，發現10 μmol/L N2E作用LX-2后，細胞線粒體膜電位明顯降低，提示LX-2在N2E作用下可能發生早期凋亡。在細胞凋亡過程中，Caspase家族起到十分重要的作用，其中Caspase-3與染色體凝聚、DNA斷裂、凋亡小體形成等密切相關[12]。細胞發生凋亡時，活化后的Caspase-3能通過影響細胞胞漿或者胞核底物來誘導細胞進一步凋亡。通過分光光度計法檢測了N2E作用LX-2后Caspase-3的活性，檢測結果進一步說明了N2E誘導LX-2凋亡與活化Caspase-3有關。

有研究提示，HDAC3調節了TGF-β1的穩定性[13]，研究發現在肝纖維化形成和逆轉過程中Ⅰ型膠原和α-SMA的表達變化伴隨著HDACs的表達變化。轉染實驗分析也證明HDAC3的沉默可以恢復因TGF-β1所誘導的Ⅰ型膠原和α-SMA的高表達，可見抑制HDAC3可以起到逆轉纖維化的作用。

本實驗證明了N2E可明顯下調肝星狀細胞LX-2中HDAC3、α-SMA、TGF-β1和Caspase-3的蛋白表達，以及促進活化后的Cleaved-Caspase-3的表達，說明N2E可能通過作用靶蛋白HDAC3來促進與凋亡相關蛋白Cleaved-Caspase-3，同時抑制α-SMA以及TGF-β1的表達，提示N2E通過抑制HDAC3來誘導肝星狀細胞LX-2的凋亡，同時也抑制TGF-β1以及α-SMA的表達。本研究結果為組蛋白去乙酰化酶抑制劑N2E在抗肝纖維化治療中的應用提供了一定的理論依據。