c-myc抑制劑10058-F4對Ph+ALL細胞凋亡的影響及相關機制研究

侯宇,廖芬芳,劉漫宇,王偉章

(廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院/廣東省生物活性藥物研究重點實驗室,廣東 廣州 510006)

費城染色體陽性(philadelphia chromosome positive,Ph+)急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)是最致命的白血病,約占成年人ALL患者的20%以及老年ALL患者的50%[1]。盡管酪氨酸激酶抑制劑改善了這一惡性疾病的預后,但仍然不能徹底治愈該疾病。因此,探索新的Ph+ALL治療方法仍然十分必要。原癌基因c-myc在細胞增殖、凋亡和分化過程中起著重要的調控作用,其異常表達在包括ALL在內的多種人類腫瘤中屢見不鮮[2]。c-myc蛋白也因此成為了許多腫瘤包括淋巴瘤和白血病治療的潛在藥物靶點[3]。然而,迄今為止c-myc小分子抑制劑抗Ph+ALL的研究卻鮮有報道。因此,本研究擬采用c-myc的小分子抑制劑10058-F4作用于Ph+ALL細胞株Sup-B15和原代Ph+和Ph-ALL細胞,通過流式細胞術檢測細胞周期和細胞凋亡,以及Western bloting檢測c-myc及其下游調控基因蛋白的表達,初步探討10058-F4抗Ph+ALL的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞培養 Sup-B15細胞購自中國科學院上海分院細胞庫。細胞培養于含20%(φ)胎牛血清(美國Gibco公司)的IMDM培養液(美國Gibco公司))中,置于5%(φ)CO2的37 ℃培養箱。ALL患者骨髓樣品經淋巴細胞分離液分離獲取白細胞,細胞培養于含20%胎牛血清的IMDM培養液中。

1.1.2 一般資料 ALL患者的骨髓樣品收集于廣東藥科大學附屬第一醫院,均確診為Ph+和Ph-初發患者,且未接受放、化療,2名患者均為女性。

1.1.3 主要儀器 FACScalibur型流式細胞儀(美國BD公司) 。

1.1.4 主要試劑 格列衛(imatinib mesylate,IM)和碘化丙啶(propidium iodide,PI)購自美國Sigma公司；PPP和10058-F4購自selleck公司；c-myc、Mcl-1、Bcl-2和Bcl-xl購自美國abcam公司；Bcl-abl、GAPDH、Bcr-abl、p-crkl、辣根過氧化物酶標山羊抗兔和羊抗小鼠IgG抗體購自美國CST公司；Bax抗體購自武漢博士德公司；凋亡試劑盒購自美國Biolegend公司；ECL購自美國Pierce公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞周期檢測 以終濃度為20、40和60 μmol/L的10058-F4和5.0 μmol/L的IM處理Sup-B15細胞不同時間(6、12、24 h) 后,收集細胞,1×PBS潤洗細胞2次,-20 ℃預冷70%(φ)乙醇固定過夜。上機前樣品用1×PBS潤洗2次,1×PBS 100 μL重懸細胞并加入RNA酶2 μL,于37 ℃條件下孵育15 min,再以1×PBS潤洗,1×PBS 100 μL重懸細胞,加入PI 5 μL,室溫避光孵育5 min,最后加入1×PBS至500 μL體積,混勻后上機檢測。

1.2.2 細胞凋亡檢測 以終濃度為20、40和60 μmol/L的10058-F4處理Sup-B15細胞48 h和72 h。原代ALL細胞經40 μmol/L的10058-F4處理72 h。處理完成后收集細胞,冰育PBS潤洗2次,離心去上清,加入1×binding buffer 100 μL 重懸,再加入Alexa Flour 647 Annexin-V 試劑4 μL,混勻,室溫避光孵育10 min。再加入PI 7 μL,最后加入1×binding buffer 200 μL調整細胞數為每毫升1×106,上機檢測。

1.2.3 Western blotting分析 不同濃度的PPP(0.5、1.0和5.0 μmol/L)、10058-F4(20和40 μmol/L)和5.0 μmol/L的IM處理細胞24 h后,收集細胞并提取蛋白。樣品經SDS-PAGE電泳分離,冰上濕轉1.5 h至PVDF膜,室溫條件下5%脫脂奶粉封閉2 h,加入含5% BSA稀釋液稀釋的c-myc、Mcl-1、Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-abl、GAPDH、Bcr-abl和p-crkl抗體(1∶1 000),4 ℃過夜,加入稀釋的相應二抗 (1∶5 000),室溫孵育1 h。洗膜后用ECL solution顯色,最后進行顯影,定影。

2 結果

2.1 c-myc抑制劑10058-F4對Sup-B15細胞凋亡的影響

20、40和60 μmol/L的10058-F4處理Sup-B15細胞48 h和72 h后,20 μmol/L的10058-F4對細胞凋亡無明顯影響,而40、60 μmol/L的10058-F4均顯著地誘導Sup-B15細胞發生凋亡(圖1)。

2.2 c-myc抑制劑10058-F4對Sup-B15細胞周期的影響

不同濃度的10058-F4以及5 μmol/L的IM處理細胞6、12、24 h后對細胞周期均無明顯影響(圖2)。

2.3 c-myc抑制劑10058-F4對c-myc及其下游調控基因蛋白表達的影響

20、40 μmol/L的10058-F4處理細胞24 h后,20 μmol/L的10058-F4對c-myc、Bcl-2、Bax、Bcl-abl和p-crkl蛋白表達均無明顯影響,而對Bcl-xl和Mcl-1的蛋白表達具有明顯的抑制作用(圖3)。40 μmol/L的10058-F4對Bcl-2、Bax和p-crkl蛋白表達均無明顯影響,而對c-myc、Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1和Bcl-abl具有明顯的抑制作用。作為陽性對照,不同濃度的PPP(0.5、1.0、5.0 μmol/L)均顯著抑制c-myc、Bcl-2、Mcl-1和p-crkl蛋白的表達,而對Bcl-xl、Bax和Bcr-abl的蛋白表達無明顯影響。5 μmol/L的IM顯著抑制c-myc、Mcl-1和p-crkl蛋白的表達,對Bcl-xl、Bcl-2、Bax和Bcr-abl的蛋白表達無明顯影響。

1. DMSO； 2.10058-F4 20 μmol/L； 3. 10058-F4 40 μmol/L； 4. 10058-F4 60 μmol/L。與溶劑對照組(DMSO)比較：*P<0.05,**P<0.01。

圖1流式細胞術檢測10058-F4對細胞凋亡的影響

Figure1Effect of 10058-F4 on cell apoptosis by flow cytometry

1. DMSO； 2. 10058-F4 20 μmol/L； 3. 10058-F4 40 μmol/L； 4. 10058-F4 60 μmol/L； 5. IM 5 μmol/L。

圖2流式細胞術檢測10058-F4和IM對細胞周期的影響

Figure2Effect of 10058-F4 and IM on cell cycle distribution by flow cytometry

1. DMSO； 2. PPP 0.5 μmol/L； 3. PPP 1.0 μmol/L； 4. PPP 5 μmol/L； 5. 10058-F4 20 μmol/L； 6. 10058-F4 40 μmol/L； 7. IM 5 μmol/L。

圖3Western blotting檢測PPP、10058-F4和IM對c-myc、Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1、Bax、Bcl-abl和p-crkl蛋白表達的影響

Figure3Effect of PPP,10058-F4 and IM on protein expression of c-myc,Bcl-2,Bcl-xl,Mcl-1,Bax,Bcl-abl andp-crkl by western blotting

2.4 10058-F4對Ph+和Ph-的原代ALL細胞死亡的影響

40 μmol/L的10058-F4處理Ph+和Ph-的原代ALL細胞72 h后,Ph+的原代ALL細胞凋亡率(AV+)顯著提高,而細胞壞死率(PI+)無明顯變化；Ph-的原代ALL細胞壞死率(PI+)顯著提高,而細胞凋亡率(AV+)無明顯變化(圖4)。

與溶劑對照組(DMSO)比較：**P<0.01。

圖4流式細胞術檢測10058-F4對細胞死亡的影響
Figure4Effect of 10058-F4 on cell death by flow cytometry

3 討論

以往的研究已經發現,c-myc的高表達在白血病發生過程中起關鍵的作用[4],抑制c-myc能夠阻止白血病的發生[5]。同時,越來越多的證據也顯示,c-myc抑制劑在多種腫瘤中均顯示出很強的抗癌活性。本研究發現,c-myc抑制劑10058-F4在誘導Ph+急性淋巴細胞白血病細胞凋亡同樣非常有效,提示10058-F4具有治療 Ph+ALL的潛能。

10058-F4是一種通過阻斷c-myc和MAX的二聚化而抑制c-myc反式激活活性的c-myc抑制劑。研究發現,在不同的腫瘤類型中它可以通過誘導細胞周期阻滯、促進細胞凋亡和細胞分化等多種途徑發揮抗癌作用。在AML細胞中,10058-F4通過抑制c-myc蛋白表達,上調CDK抑制蛋白p21和p27使AML細胞停滯在G0/G1期。同時,10058-F4通過下調Bcl-2蛋白的表達以及上調Bax蛋白的表達激活線粒體途徑誘導細胞凋亡。此外,10058-F4也通過激活多種轉錄因子誘導AML骨髓細胞分化[6]。而在腎癌細胞中,10058-F4明顯降低線粒體氧化磷酸化蛋白(NDUFS1、SDHA、UQCRC2、COXIV、OSCP)的表達,引起線粒體活性氧(ROS)產生明顯增高,從而誘導細胞凋亡[7]。10058-F4除了自身具有抗腫瘤活性外,還能夠增強肝癌細胞[8]和胰腺導管腺癌[9]對常規化療藥物的敏感性,以及逆轉CML細胞對伊馬替尼的耐藥性[10]。這些研究成果表明,10058-F4具有較為廣泛的抗腫瘤活性。以往的研究已經提示,c-myc是Ph+ALL潛在的治療靶點[11]。因此,本研究通過10058-F4進一步研究c-myc在Ph+ALL細胞中的作用及其機制。本研究發現,低濃度10058-F4(20 μmol/L)對Sup-B15細胞凋亡無明顯影響,同時對c-myc、Bcl-2和Bcl-xl亦無抑制作用,但能夠抑制Mcl-1蛋白的表達；而高濃度10058-F4(40 和60 μmol/L)顯著地誘導Sup-B15細胞凋亡,同時也明顯地抑制c-myc、Bcl-2、Bcl-xl和Mcl-1的蛋白表達,提示10058-F4促進Sup-B15細胞的凋亡與抑制c-myc調控的抗凋亡基因Bcl-2和Bcl-xl的表達相關,而與Mcl-1的表達抑制無關。此外,本研究也發現,與Bcr-abl靶向藥物IM相比,10058-F4能夠抑制Bcr-abl蛋白的表達,但對其下游靶蛋白crkl的磷酸化無影響,這與IM的作用機制明顯不同。鑒于Bcr-abl對于Ph+細胞生存的關鍵作用,抑制Bcr-abl蛋白的表達可能是10058-F4發揮抗Ph+ALL作用的一種全新的分子機制,但其抑制Bcr-abl表達的分子調控機制仍有待深入的研究。

綜上所述,本研究初步探討了10058-F4抗Ph+ALL的作用及其相關的分子機制,為將10058-F4開發成為治療Ph+ALL藥物提供理論依據。