沉默CTTN基因表達(dá)抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞侵襲的研究

劉迪 羅猛 （通訊作者）

（貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州 貴陽 550002）

浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的顯著特征,目前尚未發(fā)現(xiàn)行之有效的治療策略來抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移，因此世界范圍內(nèi)對(duì)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的研究方興未艾。最近研究發(fā)現(xiàn)，侵襲性偽足(InvadoPodia)與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有著密切關(guān)系[1]。位于染色體11q13區(qū)上的癌基因CTTN所編碼的皮層機(jī)動(dòng)蛋白Cortactin (cortical actin bindingProtein)最初被發(fā)現(xiàn)是作為致癌的酪氨酸蛋白激酶v-src的底物，與微絲激動(dòng)蛋白和致癌性酪氨酸激酶v-Src結(jié)合，從而影響細(xì)胞的侵襲性以及腫瘤轉(zhuǎn)移灶的形成[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，CTTN基因能夠促進(jìn)食管癌細(xì)胞系的運(yùn)動(dòng)和侵襲[3]。非小細(xì)胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC)是造成肺癌相關(guān)死亡的主要原因。本研究旨在通過siRNA基因沉默技術(shù)檢測(cè)CTTN基因表達(dá)下調(diào)后對(duì)NSCLC中具有較強(qiáng)侵襲性的A549細(xì)胞株侵襲能力的影響。

1.材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

肺腺癌A549細(xì)胞(美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù))以含有10%胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)的DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)作為完全培養(yǎng)基，在37℃，5%CO2濃度條件下常規(guī)培養(yǎng)。待其處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及免疫印跡

將A549細(xì)胞鋪于六孔板，每孔2ml完全培養(yǎng)基。待細(xì)胞融合度達(dá)到60%左右時(shí)采用liPofectamine2000(美國(guó)Invitrogen公司)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別將陰性siRNA和CTTN siRNA(廣州市銳博生物科技有限公司)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞(siRNA∶liPo 2000=5μl∶5μl)，48h后使用RIPA裂解液(北京索萊寶科技有限公司)裂解細(xì)胞提取蛋白，SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離。冰水浴中100V，100min轉(zhuǎn)膜。脫脂奶粉封閉1h后，兔抗Cortactin蛋白一抗(稀釋比例1∶3500，美國(guó)Abcam公司)室溫孵育1h，山羊抗兔二抗(稀釋比例1∶5000，北京索萊寶科技有限公司)室溫孵育1h，加入ECL化學(xué)發(fā)光液后于美國(guó)AlPha公司Fluorchem Q型蛋白成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光，采用Imag J軟件分析條帶灰度值。

1.3 激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)

1ml細(xì)胞懸液中計(jì)數(shù)3000個(gè)細(xì)胞加到直徑15mm的共聚焦小皿，待細(xì)胞其充分貼壁后，4%多聚甲醛固定，0.2%Triton-±s100破膜，兔抗cortactin-體(稀釋比1：1000)室溫孵育1h，羊抗兔dylight488熒光二抗(1：2000，美國(guó)Abbkine公司)再次室溫孵育1h，5μg/ml Tritc-鬼筆環(huán)肽(上海翊圣生物科技有限公司)室溫避光孵育30min后使用德國(guó)ZEISS公司LSM 700型激光共聚焦顯微鏡隨機(jī)選取5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)侵襲性偽足的細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)并計(jì)算百分率。

1.4 Transwell小室模型

實(shí)驗(yàn)前一天將Matrigel基質(zhì)膠(美國(guó)BD公司)置于4℃冰箱中融化過夜。實(shí)驗(yàn)時(shí)用預(yù)冷的槍頭抽取已用無血清培養(yǎng)基稀釋至1mg/ml的Matrigel基質(zhì)膠80μl，鋪于孔徑為8μm的Transwell小室(美國(guó)Corning公司)的膜上。基底膜水化后，從1×106/ml濃度的無血清細(xì)胞懸液中抽取200μl加至Transwell上室。24孔板下室加入700μl完全培養(yǎng)基。24h后，棄去孔中培養(yǎng)液，甲醇固定20分鐘，吉姆薩染色20min，PBS洗滌2遍后用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞。200倍顯微鏡下隨即五個(gè)視野觀察細(xì)胞，記數(shù)。

2.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用（±s）表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.結(jié)果

3.1 siRNA沉默效率檢測(cè)

如圖1所示，western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染CTTN基因的特異性siRNA(si-CTTN)后Cortactin蛋白表達(dá)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明CTTN基因的沉默可以顯著抑制Cortactin蛋白的表達(dá)。

圖1 CTTN基因沉默效率檢測(cè)

3.2 CTTN的沉默抑制A549細(xì)胞株侵襲性偽足的形成

共聚焦顯微鏡下，呈現(xiàn)紅色熒光的TRITC-鬼筆環(huán)肽標(biāo)記的F-actin和呈現(xiàn)綠色熒光的Dyligt488標(biāo)記的cortactin共定位于胞核周圍所呈現(xiàn)出的黃色熒光，即為侵襲性偽足。

如圖2所示，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與si-NC組的71.46±8.9%侵襲性偽足出現(xiàn)率相比，CTTN沉默(si-CTTN)組A549細(xì)胞中侵襲性偽足出現(xiàn)率顯著降低至22.37±4.8%(P＜0.05)。

圖2 CTTN基因沉默對(duì)A549細(xì)胞侵襲性偽足的影響 (bar=10μm)

3.3 CTTN的沉默降低A549細(xì)胞株侵襲能力

如圖3所示，Transwell細(xì)胞侵襲模型中，倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與si-NC組的220±27個(gè)侵襲細(xì)胞相比，CTTN的沉默導(dǎo)致侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低至51±10個(gè)（P＜0.05）。

圖3 CTTN基因沉默對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力的影響（×200）

4.討論

無論是在我國(guó)還是在全球范圍內(nèi)，NSCLC都已成為致死率最高的惡性腫瘤[4]。30%早期階段的NSCLC患者可通過外科手術(shù)就能治愈肺癌。然而遺憾的是，NSCLC患者被發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已處于腫瘤晚期，肺癌的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移導(dǎo)致患者已無法通過手術(shù)切除進(jìn)行治療。腫瘤的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)也嚴(yán)重影響患者的預(yù)后，導(dǎo)致生存期顯著縮短[5]。因此，如何抑制惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移，從微生物學(xué)角度考慮如何抑制腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)侵襲，是目前腫瘤學(xué)研究的重中之重。

細(xì)胞偽足是腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的主要“工具”，尤其是侵襲性偽足在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)過程中扮演著非常重要的角色。肌動(dòng)蛋白是細(xì)胞偽足的主要組成部分，也是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的主要參與蛋白[6]。另有文獻(xiàn)報(bào)道，活體熒光標(biāo)記肌動(dòng)蛋白證實(shí)，微絲骨架在侵襲性腫瘤細(xì)胞偽足前沿的延展和形態(tài)構(gòu)建中發(fā)揮重要作用[7]。CTTN基因編碼的皮層蛋白(Cortactin)是一種微絲肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，它可以與肌動(dòng)蛋白微絲的側(cè)面結(jié)合，并直接參與細(xì)胞骨架的成型[8]。目前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，cortactin是連接細(xì)胞骨架重建信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，在調(diào)控細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性、侵襲性、以及腫瘤轉(zhuǎn)移灶形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9]。目前已被證實(shí)Cortactin廣泛分布諸如層狀偽足、侵襲性偽足和細(xì)胞膜皺褶等細(xì)胞外圍[10]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，CTTN基因編碼的cortactin參與了眾多以肌動(dòng)蛋白為基礎(chǔ)的過程。cortactin在腫瘤分化、侵襲和轉(zhuǎn)移等病理情況下表達(dá)異常升高。

在本研究中，我們采用siRNA將CTTN基因進(jìn)行特異性沉默，并用western blot技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Cortactin蛋白的表達(dá)被顯著抑制，證實(shí)了CTTN基因確實(shí)編碼Cortactin蛋白，并驗(yàn)證了脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染這種方法學(xué)的可靠性。在此基礎(chǔ)上，我們使用激光共聚焦顯微鏡和Transwell細(xì)胞侵襲小室模型發(fā)現(xiàn)，CTTN基因的沉默導(dǎo)致出現(xiàn)侵襲性偽足的細(xì)胞數(shù)顯著少于對(duì)照組，并且穿過Matrigel基質(zhì)膠侵襲至Transwell下室的細(xì)胞數(shù)顯著少于對(duì)照組，差異均差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但是值得注意的是，本研究只是通過體外驗(yàn)證CTTN基因參與調(diào)控細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。動(dòng)物模型及臨床出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移的患者中CTTN基因及其編碼的Cortactin蛋白的檢測(cè)將是對(duì)本研究提供更強(qiáng)的說服力和可信度。