淡色庫蚊的弓形蟲實驗感染初報

谷晨陽 李雅菁 趙奕涵 張學順 馮苗 劉世國

（1 新鄉醫學院第一臨床學院 河南 新鄉 453003）

（2 新鄉醫學院第三臨床學院 河南 新鄉 453003）

（3 新鄉醫學院人體寄生蟲教研室 河南 新鄉 453003）

弓形蟲是寄生于溫血類動物和人類有核細胞內的寄生原蟲，在世界范圍內廣泛分布，人類普遍易感，全世界將近三分之一的人感染弓形蟲[1]。弓形蟲感染途徑有多種：生食或半生食肉類或飲用卵囊污染的水源，胎兒可經孕婦經胎盤導致感染[2]。

蚊屬于雙翅目、蚊科，是對人類威脅最大的衛生媒介昆蟲。蚊能兼吸人和動物的血，能傳播多種人獸共患疾病，如常見的瘧疾、絲蟲病、流行性乙型腦炎、黃熱病和登革熱等疾患[3]。蚊蟲有多種，常見的有按蚊，庫蚊和伊蚊，其中，淡色庫蚊是北方地區夏季的優勢吸血蚊種[4-5]。

蚊子在弓形蟲傳播中的作用至今尚未知曉。我們采用RH株弓形蟲建立小鼠弓形蟲感染模型。同時飼養當地優勢蚊種-淡色庫蚊，待雌蚊羽化交配后叮咬吸取弓形蟲感染小鼠血液，其后檢測吸血雌蚊體內弓形蟲DNA。現將實驗結果報道如下。

1.資料與方法

1.1 實驗動物

淡色庫蚊孑孓由野外捕捉。8周齡昆明小鼠由新鄉醫學院動物中心提供；RH株弓形蟲速殖子為新鄉醫學院寄生蟲實驗室液氮保存的RH株種。此實驗過程及動物使用、護理方案通過了新鄉醫學院動物倫理使用委員會的批準。

1.2 實驗材料

飼養籠（35cm×35cm×35cm，120目），電動吸蚊器、透明塑料杯、葡萄糖、小白鼠飼料、海綿、塑料盆等均為市售；2×UltraSYBR Mixture(High ROX)、2×Es Taq MasterMix(Dye)均購自北京康為世紀生物科技有限公司，蛋白酶K緩沖液購自美國Genview公司，Tris飽和酚購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 淡色庫蚊的養殖 采用標準化養殖方法[6]，飼養條件為室溫（25±2）攝氏度，相對濕度為（65±15）%，光照周期為L∶D=14h∶10h。

1.3.2 弓形蟲小鼠感染模型的建立 RH株弓形蟲速殖子1×105個腹腔內注射感染小鼠，建立弓形蟲感染小鼠模型，感染前小鼠尾部取血200μL，感染后每天均取血，加入EDTA保存。每天18∶00左右將小鼠固定于鼠板上，放入約100只成蚊(雌雄比例均衡，均選取羽化后兩至三天的成蚊，根據蚊蟲吸血高峰的調查，在此期間雌蚊處于第一個吸血高峰[7]，使其吸取小鼠血。第二天7∶00將所有蚊子取出，挑選出大部分已吸血的雌蚊，把雌蚊分別剪碎放入1.5mL離心管內，加入ProK蛋白酶緩沖液500μL，對小鼠血液和吸血蚊組織采用酚-氯仿法提取DNA；另一小部分吸血蚊做成血涂片，以便顯微鏡下觀察弓形蟲滋養體。

1.3.3 弓形蟲529序列巢式PCR 分別以小鼠血液和吸血蚊組織DNA為模板，以弓形蟲速殖子DNA為陽性，以ddH2O為陰性,進行PCR擴增[8]。

1.3.4 Real-timePCR弓形蟲蟲體量測定 以血液DNA為模板，進行熒光定量PCR檢測。外套引物F：5'-CGCTGCAGGAAGACGAAAGTTG-3'，R：5'-CGCTGCAGACACAGTGCA TCTGGATT-3',產物大小94bP，反應體系為25μL：2×UltraSYBR Mixture(High ROX)12.5μL，TemPlate DNA 4μL，Forward Primer、Reverse Primer各0.5μL，ddH2O補足至25μL。反應條件：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1.5min，35個循環；72℃1.5min；72℃ 7min。以拷貝數為2.7×107、2.7×105、2.7×103、2.7×101弓形蟲RH株滋養體DNA做標準曲線，ddH2O為空白對照。

2.結果

2.1 血涂片鏡檢

將部分吸血蚊做成血涂片，經瑞氏染色后在顯微鏡下可見弓形蟲滋養體活體，結果如圖1、2。

圖1 吸血蚊血涂片1（瑞氏染色）

圖2 吸血蚊血涂片2（瑞氏染色）

2.2 定性檢測

2.2.1 小鼠感染情況 小鼠存活時長記為5天(在感染后在第四天陸續開始死亡，至第5天全部死亡)，對小鼠斷尾取血得到血液樣本共76個，其中陽性樣本55個，陽性率為77.37%。實驗中對每天收集的小鼠血進行PCR和凝膠電泳檢測后，18只小鼠在5天內均至少有一天出現陽性條帶，結果見表1。

對實驗小鼠每天感染情況使用χ2檢驗顯示小鼠血陽性率與其感染天數有關(χ2=30.193,P＜0.001)。第一天的感染率低于后四天。通過多個樣本率比較，第一天與其余四天之間的陽性率有顯著性差異；但除第一天外其余四天間陽性率無顯著性 差異(χ21-2=13.486,P1-2=0.000；χ21-3=16.200,P1-3=0.000；χ21-4=17.578,P1-4=0.000；χ21-5=7.170,P1-5=0.007；χ22-3=0.232,P2-3=0.630；χ22-4=0.885,P2-4=0.347；χ22-5=0.000,P2-5=1.000；χ23-4=0.249,P3-4=0.618；χ23-5=0.127,P3-5=0.722；χ24-5=0.573,P4-5=0.449,critical valueχ20.005,1=7.88)。

天數 小鼠血例數（個） 陽性例數（個） 陽性率（%）第一天 18 4 22.22第二天 18 15 83.33第三天 18 16 88.89第四天 16 15 93.75第五天 6 5 83.33合計 76 55 72.37

2.2.2 吸血蚊感染情況 蚊蟲吸血實驗時長為四天，共得到吸血蚊樣本共47個，其中陽性樣本28個，陽性率為59.57%，四天內每天的吸血蚊感染情況見表2。

對實驗吸血蚊每天感染情況使用χ2檢驗顯示吸血蚊陽性率與小鼠感染天數無關(χ2=0.979,P=0.806)。另外，通過多個樣本率比較，四天間的陽性率無顯著性差異(χ21-2=0.033,P1-2=0.856；χ21-3=0.508,P1-3=0.476；

天數 吸血蚊數（只） 陽性數（只） 陽性率（%）第一天 16 10 62.50第二天 6 4 66.67第三天 16 8 50.00第四天 9 6 66.67合計 47 28 59.57

2.2.3 小鼠各自對應吸血蚊情況 實驗以供雌蚊吸血的小鼠共5只，每只小鼠對應均有一定數量吸血蚊及陽性率，見表3。

吸血蚊數（只） 弓形蟲檢出數（只） 檢出率（%）一號小鼠 9 4 44.44二號小鼠 6 3 50.00三號小鼠 12 9 75.00四號小鼠 11 6 54.55五號小鼠 9 6 66.67

對吸血蚊陽性率使用χ2檢驗顯示吸血蚊陽性率在小鼠間無差異(χ2=2.573,P=0.632)。通過多個樣本率比較，五只小鼠對應吸血蚊的陽性率之間無顯著性差異(χ21-2=0.045,P1-2=0.833；χ21-3=2.036,P1-3=0.154；χ21-4=0.202,P1-4=0.653；χ21-5=0.900,P1-5=0.343；3=1.125,P2-3=0.289；χ22-4=0.032,P2-4=0.858；χ22-5=0.417,P2-5=0.519；χ23-4=1.059,P3-4=0.304；χ23-5=0.175,P3-5=0.676；χ24-5=0.303,P4-5=0.582,critical valueχ20.005,1=7.88)。

2.3 定量檢測

2.3.1 弓形蟲拷貝數標準曲線建立

標準品 CoPies lg CoPies (X) Ct value (Y)1 27 1.431364 33.02547 2 2700 3.431364 27.68513 3 270000 5.431364 22.29853 4 27000000 7.431364 15.72101

2.3.2 小鼠體內弓形蟲拷貝數

天數 陽性小鼠平均拷貝數（μL-1）第一天 493.4751427第二天 5317.830137第三天 382214.4797第四天 3007580.570第五天 80016705.60

對小鼠血拷貝數使用方差分析顯示陽性小鼠血平均拷貝數與小鼠感染天數 有關(F=15.164,P＜0.0001)。通過多個樣本均數間的多重比較，五天間陽性小鼠血平均拷貝數有顯著性差異(F1-2=7.360,P1-2=0.027；F1-3=4.691,P1-3=0.067；F1-4=37.642,P1-4=0.000；F1-5=6.403,P1-5=0.085；F2-3=11.608,P2-3=0.006；F2-4=95.246,P2-4=0.000；F2-5=19.364,P2-5=0.003；F3-4=54.444,P3-4=0.000；F3-5=15.853,P3-5=0.007；F4-5=14.813,P4-5=0.008)。

2.3.3 吸血蚊體內弓形蟲拷貝數

天數 陽性吸血蚊平均拷貝數第一天 1657.001814第二天 1800.813196第三天 1513.882144第四天 1145.478119合計 1529.293818

對吸血蚊拷貝數使用方差分析顯示陽性吸血蚊平均拷貝數與小鼠感染天數無關(F=0.457,P=0.717) 。通過多個樣本均數間的多重比較，四天間陽性吸血蚊平均拷貝數無顯著性差異。(F1-2=0.056,P1-2=0.818；F1-3=0.033,P1-3=0.861；F1-4=0.915,P1-4=0.361；F2-3=0.235,P2-3=0.661；F2-4=4.357,P2-4=0.091；F3-4=0.431,P3-4=0.547)。

3.討論

通過實驗研究顯示，小鼠血樣本感染率為77.37%，弓形蟲在小鼠血液中的含量隨著感染時間的增加而增加(F=15.164,P＜0.0001)，結果與先前Zenner[9]報道的研究結果一致。我們的研究通過建立了急性弓形蟲感染的小鼠模型，論證了弓形蟲在小鼠血液中的含量隨小鼠感染時間的增加而增加。

先前業已有很多關于弓形蟲傳播途徑的報道，主要包括先天性感染[10]和獲得性感染[11-12]。獲得性感染有多種途徑，尤其是口腔感染；器官及骨髓移植或輸血感染；性感染。

有研究表明，兩種常見的節肢動物∶蠅[13]和蟑螂[14]，它們具有攜帶弓形蟲的能力。在中國北部和中部地區，淡色庫蚊是一種最常見的節肢動物，它能夠傳播多種病毒和寄生蟲等。然而，到目前為止還沒有任何關于蚊能夠傳播弓形蟲的報道。我們通過建立小鼠急性弓形蟲感染模型得到目標吸血蚊。首先我們制作吸血蚊血涂片，鏡下發現弓形蟲滋養體活體。然后通過吸血蚊DNA樣本，我們發現在蚊體中存在529基因，其平均陽性率為59.57%；此外，陽性吸血蚊體內的弓形蟲含量與小鼠感染天數無關(F=0.457,P=0.717)，平均每只蚊子的弓形蟲拷貝數為1529.3/只。此外，StePhanie的研究表明西尼羅病毒在蚊子體內的含量趨于一定值。在我們研究中弓形蟲的變化趨勢與西尼羅病毒類似[15]，這一現象說明弓形蟲在蚊體內的變化趨勢可能類似于西尼羅病毒，但這需要進一步的探索。

我們的實驗表明,小鼠感染后第一、二天陽性吸血蚊體內弓形蟲的含量高于陽性小鼠血液內含量,小鼠感染后第三、四天陽性吸血蚊體內弓形蟲的含量低于陽性小鼠血液內含量。Williams[16]提到蚊子在吸血過程中會有液滴的排出現象。因此，我們推測蚊子可能在液滴排出時對弓形蟲有富集現象，這可能解釋了在小鼠感染后前兩天蚊體內弓形蟲含量高的現象。

在本研究中，我們發現淡色庫蚊可攜帶弓形蟲活體，且弓形蟲在蚊子體內的含量趨于一定值。然而,在蚊吸血后正常生存狀態下，弓形蟲在其體內存活情況及變化情況仍不清楚。蚊是否是弓形蟲在動物間傳播的媒介還有待進一步研究。