水杉組織培養研究

于飛飛

（山東省北鎮中學 山東濱州 256600）

水杉（Metasequoia glyptostroboidesHu et Cheng)隸屬杉科（Taxodiaceae）水杉屬（Metasequoia），是世界上珍稀的孑遺植物，我國一級保護的特有樹種［1］。人們普遍認為它在第四紀冰川期滅絕，1941年日本研究者MiKi 通過對水杉化石的研究建立了屬名［2］。我國植物學家在湖北省利川市謀道溪鎮發現了水杉活株，經多方鑒定，1948年胡先嘯和鄭萬鈞將其正式命名為水杉，并公布于世［3］。

目前對于水杉繁育技術的研究重點主要集中在種子繁殖和扦插育苗方面［4-7］。20世紀80年代中期，水杉多代扦插苗木生長勢明顯減弱并且大量出現早衰現象，科學家發現許多地區水杉苗木重復多代扦插后，普遍出現生根推遲、生根率下降、生長勢衰退的情況［8］，影響了水杉種苗的推廣與馴化繁殖。因此其組織培養技術的建立可以在短時間內提供大量苗木，并為以后的遺傳改良、良種繁育、遺傳轉化研究工作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 培養材料 在重慶南川金佛山自然保護區原生常綠闊葉林中，采集水杉的帶腋芽莖段及頂芽為材料，培養再生植株。

1.2 培養基

1.2.1 愈傷組織誘導培養基 選取水杉生長旺盛的帶腋芽莖段或莖尖，用流水沖洗30 min，無菌條件下用75%乙醇浸泡30 s，無菌水洗凈，再用吐溫-80（2～3 滴／100 mL）和0.2% HgCl2浸洗消毒，無菌水洗凈后濾紙吸干，留取約1 cm 的長段，接種于誘導培養基中，每瓶接種3～5 個外植體，以MS 培養基為基本培養基，外加不同濃度的2，4-D、NAA、6-BA 進行離體培養，pH＝5.8，滅菌。按正交表L9（33）設計培養基表，每種激素組合接種5～6 瓶（表1），然后置于光照16 h／d，光照強度1 500 lx，（25±2）℃條件下培養。

表1 愈傷組織誘導正交實驗影響因素水平表（單位：mg／L）

1.2.2 繼代及分化培養基 將初代培養得到的叢生芽分割，轉入繼代培養基中進行增殖培養（表2）。材料接種2 周后定期觀測，活性炭實驗采用編號為5 的培養基，分別添加0.5 g／L、0.7 g／L、0.9 g／L、1.2 g／L 的活性炭對水杉的愈傷組 織進行繼代培養。

表2 愈傷組織繼代及分化培養基（單位：mg／L）

1.2.3 生根培養基 剪取健壯、葉色正常、無玻璃化的1.5～2.0 cm 長的水杉組培幼芽用于生根。以1／2 MS 為基本培養基，附加不同濃度的IBA、NAA 及一定濃度的活性炭，并定期觀察它們的生長狀況。培養基組合如表3所示。

表3 小苗生根培養基（單位：mg／L）

2 數據統計

2.1 愈傷組織誘導率統計 所有外植體從開始形成愈傷組織后，每3 d 觀察一次。以第24 天觀察統計的數據計算愈傷組織誘導率。初愈時間為在外植體上出現肉眼可見愈傷組織的時間，愈傷組織誘導率=（出愈外植體數／接種無感染外植體數）×100%。

2.2 繼代培養過程中分化情況及褐化率統計 繼代培養后，每5 d 觀察一次，記錄愈傷組織生長情況，后進行分化情況統計，20 d 后進行褐化情況統計。

3 結果與分析

3.1 愈傷組織的誘導 正交實驗結果見表4和表5。在不同的激素種類及濃度的處理中，水杉外植體大部分都能產生愈傷組織。采用培養基MS+2，4-D（2.0 mg／L）+NAA（3.0 mg／L）+6-BA（1.5 mg／L），水杉愈傷組織誘導率為91.4%，初愈時間為20 d 左右（圖1）。

表5 外植體愈傷組織誘導正交實驗方差分析表

3.2 愈傷組織的繼代與分化 從表6可以看出，不同激素及其配比對水杉愈傷組織的繼代及分化存在明顯差異，分化培養基最佳為MS+NAA（0.2 mg／L）+6-BA（1.5 mg／L），出芽率為30.2%（圖2顯示愈傷組織形成芽點）。由表7方差分析可見，其中6-BA 濃度對萌芽率的影響及為顯著，而NAA 濃度對萌芽率的影響不顯著。

表6 愈傷組織繼代及分化實驗結果分析

表7 愈傷組織繼代及分化實驗方差分析表

3.3 5 號培養基褐化結果分析 水杉外植體的褐變現象比較嚴重，0.9 g／L 的活性炭對于防止外植體褐變效果最好，可以把褐變率降低到25.9%并保持較高的出芽率（21.5%）。但是，實驗結果顯示活性炭能夠阻礙組培苗莖的伸長，而促進葉的迅速生長。

3.4 水杉組培苗生根結果分析 由表8可以看出，水杉不定根的誘導比較困難，在1／2MS+NAA（3.0 mg／L）+IBA（0.1 mg／L）培養基上生根率最高僅為18.8%（圖3）。將已經生根的小苗轉移到不含激素的MS 培養基上，根系會繼續伸長生長并且發生不定根（圖4），培養15 d 后平均根數可達到45條，平均根長達2.56 cm，最長根長4.51 cm。

表8 水杉組培苗生根誘導實驗結果

表9 水杉組培苗生根誘導實驗方差分析表

4 結論

4.1 水杉愈傷組織誘導率高 本實驗中，水杉外植體萌動率較高，研究發現，采用培養基MS+2，4-D（2.0 mg／L）+NAA（3.0 mg／L）+6-BA（l.5 mg／L），水杉愈傷組織誘導率為91.4%，初愈時間為20 d左右。水杉在繼代培養中觀察到3 種類型的愈傷組織：①質地疏松或致密的黃色愈傷組織，多次繼代培養生長快；②質地致密黃綠色或白色的愈傷組織，多次繼代培養仍能增殖；③質地疏松黃褐色的愈傷組織，生長緩慢，在繼代培養中絕大多數變褐死亡，只有其中少數愈傷組織能產生新的白色愈傷組織。

4.2 水杉組培成苗率低 水杉離體組織培養獲得再生植株從理論上應該可以成功，卻只有少部分成苗，未能獲得突破性進展。探究原因，可能主要在以下2 個方面：一是該屬植物遺傳特性所致，水杉為木本裸子植物，木本植物再生率低一直是困擾其再生的主要原因；二是所提供的培養條件可能不適于水杉外植體的生長，通常外植體的萌發成苗與光照、溫度、水分和通氣條件等因素密切相關，同時其代謝產物也會或多或少影響植株的生長。最佳分化培養基組合為MS+NAA（0.2 mg／L）+6-BA（1.5 mg／L），出芽率為30.2%，叢芽產生率較低。最佳生根培養基組 合為1／2MS+NAA（3.0 mg／L）+IBA（0.1 mg／L），生根率最高僅為18.8%。