32例智力低下發育遲緩患兒基因組拷貝數變異的分析

黨穎慧 宋婷婷 萬陜寧 鄭蕓蕓 黎 昱 陳必良 張建芳

兒童智力低下(mental retardation，MR)和發育遲緩(developmental delay，DD)是一類嚴重危害兒童健康的疾病，發生率約為 2.3%[1]。在我國導致智力低下的先天性因素中，遺傳病約占 40.5%，而染色體因素占遺傳因素的 37.0%[2]。染色體微陣列分析技術(CMA)是一種全新的分子核型分析技術，具有敏感度高、分辨率高、自動化程度高等優點，在遺傳性疾病和正常人群中能檢測出各種基因拷貝數變化，應用CMA對CNVs進行深入研究是國內外研究該病遺傳機制的發展趨勢，但國內應用經驗仍有限[3]。本研究應用CMA對32例不明原因的MR/DD患兒進行全基因組掃描與分析，探討CMA對不明原因MR/DD患兒可能的分子病因診斷的作用。

對象與方法

1.篩選標準:選擇2015年1月～2017年11月到筆者醫院兒科及遺傳咨詢門診就診的患兒32例為本次調查對象，選擇標準包括：①臨床診斷為智力低下/發育遲緩患兒；②無明顯圍生期異常病史，無明確出生后缺氧、中毒、頭顱外傷及中樞神經系統感染等病史；③無甲狀腺功能異常，無顱內腫瘤；④常規染色體核型正常；⑤排除已知的遺傳性綜合癥和遺傳性代謝病導致的智力低下。其中男性患兒14例，女性患兒18例，患兒年齡2個月～10歲，主要表現為智力低下、生長發育遲緩、特殊面容等。根據不同的年齡段分別采用《Gesell發育量表》和《中國韋氏智力量表》測定兒童的發育商(DQ)或智商(IQ)，同時運用《嬰兒-初中生社會適應性能力量表》進行社會適應性能力評價。IQ或DQ<70，伴社會適應性能力低下者診斷為MR，5歲稱為MR，<5歲稱為DD；以下統稱為MR/DD。告知所有患兒監護人CMA的檢測范圍及局限性，簽署書面知情同意書。本研究獲得筆者醫院醫學倫理學委員會批準。

2.檢測方法：皮膚表面常規消毒后抽取靜脈血2ml，使用 DNA 提取試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit)按說明書操作方法提取基因組DNA。應用Affymetrix公司的Cytogenetic CytoScan 750K Array全基因芯片掃描技術檢測全基因組CNVs。Affymetrix CytoScan 750K Array芯片包含有20萬SNP標記和55萬CNV標記，以平均大約1marker/4kb的密度分布于人類的整個基因組，用于檢測全基因組染色體。按試劑盒說明書操作：將DNA溶解于AE buffer 溶液并將DNA 濃度調整至50ng/μl。對DNA樣品進行酶切、連接、PCR擴增。將擴增產物用磁珠法進行純化，純化后的PCR產物進行片段化處理，片段在25～125bp。片段化后的產物在末端脫氧核糖轉移酶(TdT)的作用下進行標記反應。標記完成后和雜交試劑混合，95℃ 10min，49℃孵育2min后取200μl樣本載入到置密的芯片中，密閉50℃，60r/min雜交16～18h。然后將芯片放入洗染工作站內完成洗滌、SAPE染色等步驟。洗染結束后將芯片放入掃描儀進行掃描。用Affymetrix GeneChip Scaner生成原始cel文件通過AGCC軟件芯片圖像顯示分析，利用CHAS軟件對結果進行分析。

3.CMA檢測結果判定:對于檢測出的CNVs通過與公共數據庫UCSC、ISCA、DGV、DECIPHER、OMIM等數據庫進行比對分析判斷其性質，結果分為：①致病性CNVs；②意義不明確CNVs；③意義不明確，可能致病CNVs；④意義不明確，可能良性CNVs；⑤良性CNVs[4]。

結 果

1.32例MR/DD患兒的染色體拷貝數異常情況:在32例不明原因的MR/DD患兒中，共檢出16例存在CNVs，臨床表現詳見表1。其中致病性CNVs 8例(25%，8/32)，意義不明確CNVs 6例(19%，6/32)，意義不明確、可能良性CNVs 2例(6.3%，2/32)。

表1 16例MR/DD患兒臨床表現

表2 CMA檢出的8例致病性CNVs結果對比

2.16例患兒CNVs結果分析:16例患兒中存在CNVs，8例為致病性CNVs，陽性率25%，其中存在缺失6例，重復1例，重復合并缺失1例，所檢出的CNVs大小為(0.22～17.00)Mb；3例確診為已知綜合征患兒，分別是1q21.1缺失綜合征(1q21.1 deletion syndrome)，瓦登伯格綜合征(Waardenburg syndrome)，史密斯-馬吉利綜合征(Smith-Magenis syndrome)，詳見表2。意義不明確CNVs 6例(19%，6/32)，其中缺失2例，重復1例，雜合性缺失3例，所檢出的CNVs大小為(0.42～19.50)Mb，>10Mb的片段有6個，詳見表3。另外意義不明確，可能良性有2例。

表3 CMA檢出的意義不明確CNVs結果對比

討 論

智力障礙是一類遍及全世界的嚴重危害兒童身心健康的一類疾患，初步估計目前約15%～20%的智力障礙是由于亞顯微的染色體拷貝數變異造成的。國外研究已證實在不明原因MR/DD患者中10%～20%存在基因組不平衡，并認為這種基因組失衡是MR/DD甚至神經精神疾患的致病原因之一[5]。G顯帶染色體核型分析作為首選技術已廣泛用于染色體異常的檢測，但是其分辨率有限，而CMA能夠在全基因組水平進行掃描，尤其是對于檢測染色體組微小缺失及重復等不平衡性重排具有突出優勢，2010年細胞分子遺傳學芯片國際標準(International Standard CytogenomicArray，ISCA) 協會在研究了21698例具有異常臨床表征，包括智力低下、發育遲緩、多種體征畸形以及自閉癥的先證者的基礎上，發現CMA對致病性CNV的檢出率為12.2%，比傳統G顯帶核型分析技術的檢出率提高了10%。美國醫學遺傳學會建議，將CMA作為生長發育遲緩、智力低下和孤獨癥譜系疾病的一線診斷技術，而不再使用傳統的顯帶核型分析技術[6]。

本研究應用CMA檢測不明原因MR/DD患兒32例，檢測出16例患兒存在CNVs，其中8例發現致病性CNVs，陽性率25%(8/32)。利用CMA在兒科遺傳病的臨床應用專家共識中針對智力落后和(或)發育遲緩患者進行CNVs檢測，陽性率約為19.2%，二者數據結果基本一致[7]。

在32例患兒中，病例1至病例8檢測結果為致病性CNVs。病例1檢出9號染色體9q22.33q31.3區域有約12.4Mb的缺失，9q22.32q32區域約17Mb的嵌合缺失，該缺失區域包含多個OMIM基因，數據庫顯示可能與特殊面容、牙齒發育不全，小腦畸形，聽力受損相關，此外4號染色體4q35.2區域約680kb的缺失，但沒有OMIM基因，有病例報道該區域的缺失與克羅恩病相關，染色體4q缺失綜合征是一種罕見的疾病(1∶100000的發生率)，具有不同的臨床表型，取決于涉及的區域，其包括發育遲緩和異型[8]。4q33區域已被提議為4q缺失綜合征的關鍵區域，而涉及4q34～4q35的更遠端缺失與輕度畸形、表型和智力障礙有關[9]。病例2檢出12號染色體12p13.33p12.3區域有約16.7Mb的重復，13號染色體13q34區域3.6Mb的缺失。12p13.33p12.3區域含有RAD52、WNK1和HSN2等178個OMIM基因，Decipher數據庫顯示該區域的重復可能與發育遲緩，智力低下相關。

13q缺失綜合征(OMIM:613884)是以生長發育遲緩、智力障礙、先心病和癲癇為特征的染色體病癥，不同區域不同位置臨床表現不同，長臂末端13q33～34，主要與嚴重的智力障礙相關，此13q34區域3.6Mb的缺失包含18個OMIM基因，Decipher數據庫及相關文獻顯示該區域缺失與語言障礙、發育遲緩、先心病及智力低下等臨床癥狀有關[9,10]。病例3檢出1號染色體1q21.1q21.2區域有約1.99Mb的缺失，該缺失區域包含13個OMIM基因，且與OMIM數據庫中的1q21.1缺失綜合征(1q21.1 deletion syndrome，OMIM:612474)有重疊區域，有文獻提示該區域缺失患者與喂養困難、生長發育遲緩、智力低下、小頭畸形等臨床表現相關。1q21.1缺失綜合征患者表現多樣化，大多患者伴有輕到重度的發育遲緩，先天性多發畸形[11]。病例4檢出2號染色體2q35q36.1 區域有約5.8Mb的缺失，該區域包含PAX3、DES、EPHA4等52個OMIM基因，ISCA、Decipher、Clinvar等數據庫顯示該缺失具有致病性，與語言發育遲緩、智力低下、先心病等有關。該缺失區域包含PAX3基因，此基因的缺失或突變會引起瓦登伯格綜合征(Waardenburg syndrome，OMIM:193500)，它是一種臨床罕見的常染色體顯性遺傳性疾病，主要表現為皮膚、毛發和眼睛的色素異常、感覺神經性耳聾及其他畸形等臨床表現。有報道該基因缺失與先心病也有關[12]。

此外2q33.2q37.3區域有約36Mb的嵌合缺失。病例5檢出17號染色體17p11.2區域有約3.1Mb的缺失，包含COPS3、NT5M、RAI1等31個OMIM基因，該缺失區域與史密斯-馬吉利綜合征(Smith-Magenis syndrome，OMIM:182290)區域有重疊，包含的劑量敏感型RAI1基因為該綜合征的關鍵基因，Decipher、ISCA、Clinvar等數據庫及文獻顯示該區域缺失的患者大多數伴有智力低下、睡眠障礙、自我傷害行為、語言表達能力障礙、牙齒異常等臨床表現[13,14]。病例6檢出18號染色體18q22.2q23區域有約10.8Mb的缺失，該缺失區域包含GALR1、MBP、TSHZ1等24個OMIM基因，Clinvar、Decipher、OMIM等數據庫及文獻顯示該區域缺失的患者可能有發育遲緩、顱面部異常、身材矮小、張力減退、語言表達能力障礙、聽力損傷、腭裂等臨床表現[15]。病例7檢出20號染色體20q11.21q11.23區域有約6.4Mb的重復，該重復區域包含ASXL1、DNMT3B、EPB41L1等68個連續的OMIM基因，Decipher、ISCA、Pubmed等數據庫顯示該區域重復較為罕見，但有該區域重復致病的病例報道，該區域重復的患者可能有發育遲緩、內眥贅皮、顱面部異常、語言表達能力差等臨床表現[16]。病例8檢出2號染色體2q24.3區域有約222 kb的缺失，該缺失區域包含SCN3A和SCN2A 2個OMIM基因，這兩個基因均為鈉離子通道α亞基基因家族成員，SCN2A基因雜合突變或缺失與癲癇性腦病及自閉癥相關，有文獻報道顯示該區域缺失的患者可能有癲癇、自閉癥、神經系統異常、精神阻滯、小頭畸形等臨床表現[17,18]。

本研究32例患兒中，檢測出意義不明確CNVs 6例(19%，6/32)，意義不明確、可能良性CNVs 2例(6.3%，2/32)。其中病例9～病例14結果為意義不明CNVs，病例15和病例16結果為意義不明確、可能良性CNVs，因為缺失區域包含著絲粒位置且探針較少。病例9檢出Y染色體Yq11.223q11.23區域約2.2Mb的缺失，Yq11.23區域約885kb的缺失，該缺失區域與國際公共良性CNVs數據庫(DGVs)不重疊，包含DAZI、DNZ2等OMIM基因，該區域的缺失可能與男性生殖細胞的發育與無精癥相關。病例10檢出X染色體Xp11.23p11.1約11.4Mb的缺失，該區域含有133個OMIM基因，致病性尚不明確。病例11檢出9號染色體9q33.3有約420kb的缺失，該區域包含2個OMIM基因，致病性不明確。14號染色體14q11.2有約434kb的缺失，該區域無OMIM基因。病例12檢出多條染色體大于10Mb的缺失，但這些缺失區域包含多個隱性致病基因，臨床意義尚不明確，雜合性缺失會增加隱性遺傳病的發病風險。病例13檢出Y染色體Yq11.223q11.23、Yq11.23區域分別有約1.21Mb、1.35Mb的重復，該重復區域與DGVs數據庫不完全重疊，共包含7個OMIM基因，但Decipher、Clinvar 等數據庫顯示該區域重復的臨床意義尚不明確。病例14檢出4號染色體4q21.21q22.1區域有約12Mb的雜合性缺失，該區域是否攜帶與遺傳印記相關的基因尚不明確，但包含的隱性致病基因會增加隱性遺傳病的發病風險。

對于CNV的臨床意義不明確，可能是致病性，也可能是良性，即還沒有足夠的證據或標準證實其臨床意義，其結果的解釋很具有挑戰性，可通過對雙親的進一步檢測來明確，如果該CNV來自其沒有表型的雙親，則良性的可能性大，而如果是新發的，則致病的可能性更大。但本研究中意義不明確的病例因為其他原因沒有進行雙親的檢測。

CMA可在全基因組范圍進行高分辨率掃描，不僅能檢出染色體不平衡性變異，而且能檢出亞顯微水平的拷貝數變異。缺點是在正常人類基因組中廣泛存在沒有臨床意義的良性CNV/常見 CNV。CMA目前最大問題是對結果的正確解讀，其原因在于該技術能找出約1%的不確定性的拷貝數變異，這會給遺傳咨詢帶來一定的困擾，即使CMA存在上述一些缺點，但CNV檢測仍具有顯著優勢，其臨床應用價值不可低估[19]。由于正常人CNVs數據庫還不完善導致部分檢測到的CNVs臨床意義判斷困難，所以本研究中有6例患者目前僅能判斷意義不明CNVs。另外2例缺失區域包含著絲粒位置且探針較少，可能為良性。

CNVs相關的微缺失或微重復是不明原因MR/DD的主要病因，但是如何發現和評估罕見致病性CNVs已成為目前一個面臨挑戰的重要任務，評估因素主要包括：①是否在正常人群中有報道；②是否為新生CNVs；③CNVs長度是否足夠大；④是否在數據庫中有報道，且攜帶者具有RR/DD表型。這些CNVs無法被染色體核型分析所識別，CMA可提高對不明原因MR/DD患兒的分子病因診斷水平，對進一步研究MR/DD病因機制具有重要意義，也可為患兒預后和家庭再發風險評估進行指導。