MiR-144-3p抑制NFE2L2的表達降低宮頸癌細胞的增殖和遷移

王志景，馬麗麗，王 慧，程 珂，何全中，孫 力

(新鄉醫學院第三附屬醫院婦產科，河南新鄉 453003)

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤，嚴重影響我國婦女的健康。在我國，宮頸癌的發生率為98.9/100 000，病死率達到30.5/100 000，而且有逐漸年輕化的趨勢[1]。宮頸癌的發生原因相對明確，即HPV病毒的反復感染。但是宮頸癌發生和轉移的機制相對復雜，目前尚未完全闡明。筆者前期的研究發現，miR-144-3p在宮頸癌組織中的表達降低，本研究在體外進一步驗證miR-144-3p對宮頸癌細胞株的作用，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1材料與儀器 胎牛血清和RPMI 1640細胞培養基購自美國Hyclone公司，青-鏈霉素雙抗、考馬斯亮藍、凝膠試劑盒、硝酸纖維素膜、ECL發光試劑盒、兔抗人一抗和羊抗兔二抗購自博士德生物工程有限公司，CCK-8試劑盒、反轉錄試劑盒均購自碧云天生物工程有限公司，實時定量PCR試劑盒購自天根生物工程有限公司，倒置相差顯微鏡及熒光顯微鏡均購自日本Nikon公司。

1.2細胞培養 宮頸癌Hela細胞購自中國科學院上海細胞庫。用含10%胎牛血清，100 μg/mL青霉素及0.1 mg/mL鏈霉素的PRMI1640培養基培養，并置于含5%CO2的37 ℃細胞培養箱中。每2～3天換液1次。倒置相差顯微鏡觀察細胞生長情況，鋪滿80%左右時，用0.25%胰酶(含0.02%EDTA)進行消化，按1∶3比例進行傳代。細胞對數生長期內進行實驗。

1.3細胞轉染 細胞生長約80%時進行轉染。將miR-144-3p mimics(mimics 組)、inhibitors(inhibitors組)和陰性對照(NC組)(僅使用Lipofectamine 2000)轉染細胞，以未進行干預的Hela細胞為正常對照組(Hela組)，操作步驟按照說明書進行，每組設3個復孔。

1.4CCK-8檢測細胞增殖活性 細胞轉染48 h后，消化離心，按每孔約2×103個細胞的濃度接種于96孔板中，每組設3個復孔。培養過夜吸棄培養基，用不含血清的DMEM培養基漂洗2遍，每孔加入CCK-8染色液100 μL，37 ℃避光孵育染色1 h，用酶聯免疫標記儀測定細胞的吸光值(A450)，計算出細胞的增殖率(以NC組為100%計算)。

1.5Transwell檢測細胞遷移能力 細胞轉染48 h后，分別將3組細胞制成約106/mL的細胞懸液(培養基不含胎牛血清)，取200 μL接種于上層小室內，下層小室內加入300 μL含10%胎牛血清的培養基作為化學誘導物，每組設3個復孔。37 ℃培養24 h后，取出下層小室，吸干培養基，加入4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌3次，Gemisa溶液染色5 min，在高倍鏡下(×400)選取5個視野計數細胞，取平均數作為實驗結果。以對照組為100%，計算各組細胞的遷移率。

1.6實時定量PCR檢測NFE2L2 mRNA的變化 轉染后取對數生長期的細胞，采用Trizol法提取細胞總RNA，按說明書進行操作。分光光度計測定RNA濃度后，取1 μg RNA反轉錄為cDNA，操作過程按反轉錄試劑盒說明書進行。引物序列：NFE2L2上游引物為5′-ACACGGTCCACAGCTCATC-3′，下游引物為5′-TGTCAATCAAATCCATGTCCTG-3′； GADPH內參 正義鏈5′-CTTCATTGACCTCAACTAC-3′，反義鏈5′-GCCATCCACAGTCTTCTG-3′。采用25 μL反應體系，按說明書進行。PCR反應條件：95 ℃預變性 5 min；95 ℃變性 10 s，60 ℃退火延伸30 s，共40個循環。采用2-ΔΔCt法進行分析。

1.7蛋白提取和Western Blot檢測NFE2L2水平 轉染后取對數生長期的細胞以106/mL的密度種植于6孔板中培養過夜。4 ℃ PBS漂洗3次；0.25%胰酶消化并收集細胞(漂洗液離心后收集細胞)，加入200 μL RIPA裂解液(含體積分數為1%的PMSF)置于冰上裂解30 min。4 ℃ 12 000 r/min離心15 min(低溫離心機提前30 min啟動并預冷)，收集上清液，考馬斯亮藍法測蛋白濃度。用RIPA裂解液調整樣品蛋白濃度至相同水平，熱變性蛋白。取相同總量的蛋白質進行凝膠電泳，轉膜，孵育一抗(1∶1 000稀釋)4 ℃過夜。加入二抗(1∶2 000稀釋)，室溫孵育2 h，TBST漂洗3次，每次10 min。 在暗室內使用ECL發光液發光，壓片后曝光盒曝光。圖片照相后用Qantity-One分析軟件進行分析測定。

2 結 果

2.1CCK-8結果顯示miR-144-3P抑制Hela細胞的增殖 轉染48 h后，mimics組細胞的增殖活性為(83.2±2.0)%；而inhibitors組細胞的增殖活性為(113.0±0.8)%，與NC組(100.2±0.2)%相比，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。而NC組和Hela組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。

圖1 轉染后各組細胞的增殖活性情況

2.2miR-144-3p抑制Hela細胞的遷移能力 轉染48 h后,mimics組Hela細胞遷移到下層的數目為(78.3±3.5)個，而inhibitors組的數目為(109.3±4.2)個，和NC組(96.0±4.0)個相比，差異有統計學意義(P<0.05)；而NC組和Hela組相比，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2。

2.3miR-144-3p抑制Hela細胞NFE2L2的表達 實時定量PCR結果發現，以正常Hela細胞為參照，NC組、mimics組和inhibitors組中NFE2L2的相對表達量分別為1.00±0.03、0.40±0.01、1.94±0.04，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。而Western Blot結果顯示，mimics組中NFE2L2的蛋白表達量明顯降低，inhibitors組的表達量顯著升高，和NC組(1.00±0.03)相比，差異有統計學意義(P<0.05)，而NC組和Hela組之間差異無統計學意義(P>0.05),見圖4。

圖2 轉染后各組細胞遷移細胞數目情況

圖3 轉染后各組NFE2L2的表達情況

圖4 Western Blot結果顯示各組NFE2L2的表達情況

3 討 論

MiRNAs是1993年在線蟲中被發現的[2]。目前，醫學界已經發現它在多種物種中均有表達，而且在心血管、感染、自身免疫性疾病和代謝障礙等方面發揮重要的調節作用[3-4]。研究表明，miRNAs在腫瘤的發生、發展中起重要的調節作用，可以作為癌基因或抑癌基因調節腫瘤的增生、浸潤和轉移等過程[5]，有些miRNA有成為是腫瘤診斷標志物的潛力[6]。

miR-144-3p是miR-144的成熟體，在多種生理和病理過程中有發揮重要的調節作用。在創傷后的恐懼消退實驗中發現，miR-144-3p集中表達在杏仁核附近，并促進恐懼消退的恢復，說明在中樞神經受損后miR-144-3p能夠促進其恢復[7]。過表達的miR-144-3p能夠抑制骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化，通過熒光素酶報道實驗和Western Blot結果顯示，其能夠通過抑制Smad4發揮作用[8]。在帕金森的發病過程中，過表達的miR-144-3p能夠抑制β-前淀粉樣蛋白，上調線粒體功能相關的重要基因如過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1α(PGC-1α)、核呼吸因子1(NRF-1)和線粒體轉運因子A(TFAM)的表達，并且增加細胞內三磷酸腺苷(ATP)和細胞活性，而β-前淀粉樣蛋白表達增多則起到相反的作用[9]，說明miR-144-3p在帕金森病的發生過程中發揮重要的作用。

在腫瘤的發生和發展過程中，miR-144-3p也發揮重要的作用。在一項肝癌細胞的研究中發現，和癌旁組織相比，miR-144-3p表達明顯下降，而且和患者的手術和預后存在相關性；通過生物學分析發現，其調節多種細胞功能和多條肝癌細胞相關的病理通路，包括P53通路[10]。在喉鱗狀細胞癌的體外研究中發現，miR-144-3p能夠特異性地作用于E26特異轉錄因子1(ETS-1)，部分通過抑制上皮-間質的轉化從而抑制細胞的增殖、浸潤和轉移[11]。在多發性骨髓瘤患者的血漿及細胞系中，miR-144-3p的表達均明顯降低，而體外過表達miR-144-3p能夠明顯地抑制細胞的增殖和集落形成，促進細胞周期的停滯和凋亡；進一步檢測發現其是通過抑制c-MET的表達，從而調控PI3K/AKT通路來發揮作用的[12]。在這些腫瘤中，miR-144-3p均發揮抑癌基因的作用。在急性髓系白血病的研究中發現，miR-144-3p在骨髓和外周血中的表達均明顯升高，而且在細胞系HL-60中表達也明顯增高，通過雙熒光素酶報道實驗發現其靶基因為NRF2。抑制miR-144-3p的表達后，NRF2能夠降低細胞的活性并促進細胞的凋亡[13]。說明在急性髓系白血病中，miR-144-3p發揮癌基因的作用。而在腎透明細胞癌中的研究也發現，miR-144-3p能夠促進細胞的增殖、浸潤和耐藥性的形成，發揮癌基因的作用[14]。這些研究說明，miR-144-3p在不同的腫瘤中發揮抑癌基因或癌基因的作用。筆者之前的研究發現，在宮頸癌中miR-144-3p的表達明顯降低，而且和患者的臨床特征相關，推測其可能發揮抑癌基因的作用。筆者通過體外研究進一步發現miR-144-3p能夠抑制細胞的增殖和浸潤。

NFE2L2是細胞內抗氧化應激的主要轉錄因子，在生理及病理過程中發揮重要的調節作用[15]。匈牙利的一項兒童哮喘的病例對照研究發現，NFE2L2的基因多態性和環境污染后感染引起的哮喘有相關性[16]。而NFE2L2的突變，會導致體內氧化-還原系統失衡，在多種腫瘤的發生和發展中發揮重要的作用。在結腸癌細胞系中研究發現，抑制NFE2L2的表達會導致miR-181c的激活，抑制線粒體的電子傳遞鏈的重要單位細胞色素C的氧化酶，從而抑制細胞內ATP的生成[17]。在惡性黑色素瘤中的標本免疫組織化學研究中發現，和原發灶相比，在轉移灶中NFE2L2的表達更高而KEAP1的表達降低，而且細胞核中NFE2L2的表達和遠處轉移及TWIST蛋白的表達相關，而且MFE2L2和TWIST蛋白均表達和患者的預后差明顯相關，說明NFE2L2在惡性黑色素瘤的轉移和上皮-間質轉化中可能發揮重要的作用[18]。而在維吾爾族婦女宮頸鱗癌中的研究發現，和宮頸上皮內瘤變及正常宮頸組織相比，NFE2L2的表達升高；宮頸癌細胞系中的研究發現，抑制NFE2L2表達能明顯地抑制腫瘤細胞的增殖和浸潤[19]。說明NFE2L2在宮頸癌的發生、發展中發揮重要的作用。筆者前期的研究結果證實，NFE2L2在宮頸癌中的表達是升高的；在本研究中，抑制NFE2L2的表達能夠降低宮頸癌細胞的增殖和浸潤。

綜上所述，本研究在細胞系中驗證了miR-144-3P在宮頸癌細胞中的作用，并進一步驗證其靶基因可能是NFE2L2。但是本研究仍存缺陷，沒有采用雙熒光素酶法進行直接觀察。本研究觀察到miR-144-3p在宮頸癌的作用，但是其具體的調控成熟及其發揮作用的途徑尚需要進一步的研究。