血清miR—125a表達水平在慢性阻塞性肺疾病早期診斷中的應(yīng)用價值

劉士平 王曉鵬 匡秋江

[摘要]目的 探究血清miR-125a作為生物標志物在慢性阻塞性肺疾病（COPD）早期診斷中的價值。方法 選取2017年1月～2018年6月我院收治的50例COPD患者作為COPD組，另選取同期50例正常人群作為健康對照組，50例重度吸煙者作為重度吸煙組。收集三組的外周血清標本及臨床基本資料，運用實時熒光定量法檢測三組的外周血清miR-125a表達水平，對血清miR-125a表達進行ROC曲線分析，并記錄三組的創(chuàng)面愈合率。結(jié)果 COPD組血清miR-125a的mRNA表達水平明顯低于重度吸煙組，重度吸煙組血清miR-125a的mRNA表達水平顯著低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。重度吸煙組ROC曲線下的面積大于COPD組，COPD組ROC曲線下的面積大于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。重度吸煙組、COPD組的創(chuàng)面愈合率均低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 血清miR-125a在COPD和重度吸煙患者中的表達水平均降低，可將血清miR-125a作為COPD早期診斷的生物標志物，為預(yù)防提供依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]慢性阻塞性肺疾??；miR-125a；生物標志物；早期診斷

[中圖分類號] R733.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2019）4（c）-0008-04

Application value of serum miR-125a expression level in the early diagnosis of chronic obstructive pulmonary disease

LIU Shi-ping WANG Xiao-peng KUANG Qiu-jiang LIAO Xiao-hong ZHANG Rong-shan

Department of Geriatrics， Cangzhou People′s Hospital， Jiangxi Province， Ganzhou 341000， China

[Abstract] Objective To investigate the value of serum miR-125a as a biomarker in the early diagnosis of chronic obstructive pulmonary disease （COPD）. Methods A total of 50 patients with COPD who were admitted to our hospital from January 2017 to June 2018 were selected as the COPD group. Another 50 normal people were selected as the healthy control group and 50 severe smokers were used as the severe smoking group. The peripheral serum samples and clinical basic data were collected of three groups. The expression levels of miR-125a in peripheral blood of the three groups were detected by real-time fluorescence quantitative method， the ROC curve of serum miR-125a expression was analyzed and the wound healing rate of the three groups was recorded. Results The mRNA expression level of serum miR-125a in the COPD group was significantly lower than that in the severe smoking group， the mRNA expression level of miR-125a in the severe smoking group was significantly lower than that in the healthy control group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. The area under the ROC curve of the severe smoking group was larger than that of the COPD group， and the area under the ROC curve of the COPD group was larger than that of the healthy control group， with statistically significant differences （P<0.05）. The wound healing rate of the severe smoking group and the COPD group was lower than that of the healthy control group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion The expression levels of serum miR-125a decrease in patients with COPD and severe smoking， and serum miR-125a can be used as a biomarker for the early diagnosis of COPD to provide a basis for prevention.

[Key words] Chronic obstructive pulmonary disease； miR-125a； Biomarkers； Early diagnosis

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonarydisease，COPD）是全球肺部疾病患者死因之一，其通過對氣道的破壞，以肺實質(zhì)和肺血管的慢性炎癥為主要特征，呼吸道氣流出現(xiàn)受限不完全可逆、進行性加重現(xiàn)象，發(fā)病率逐年上升[1]。目前對于COPD的治療手段尚不完善，但可在控制疾病的發(fā)生對COPD進行預(yù)防。在患者和高危人群中尋找分子生物標志物，有助于早期篩查相關(guān)疾病[2]。研究表明，血液循環(huán)中的血清miR-125a水平mRNA表達，象征疾病的發(fā)生和發(fā)展階段。血液樣品在臨床易于獲取，mRNA在血清及血漿中可以抵抗內(nèi)源性RNA酶而非常穩(wěn)定地存在，其可在多種儲存條件和反復(fù)凍融情況下保持穩(wěn)定[3-4]。近年來研究表明，miR-125a通過靶向效應(yīng)器程序來穩(wěn)定調(diào)節(jié)性T細胞介導(dǎo)的免疫穩(wěn)態(tài)[5]，COPD是一種慢性炎癥性疾病，主要涉及T淋巴細胞浸潤，而T淋巴細胞屬于機體免疫應(yīng)答的重要部分[6-7]。本研究分別對COPD患者、重度吸煙者、正常人群的外周血清miR-125a的表達水平進行檢測，旨在探究外周血清miR-125a在患者和高危人群的早期診斷價值，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2017年1月～2018年6月我院收治的50例COPD患者作為COPD組，另選取同期50例正常人群作為健康對照組，50例重度吸煙者作為重度吸煙組。健康對照組中，男28例，女22例；年齡20～60歲，平均（38.61±5.26）歲。重度吸煙組中，男28例，女22例，年齡21～61歲，平均（38.65±5.21）歲。COPD組中，男28例，女22例，年齡22～60歲，平均（37.25±4.32）歲。三組的一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究中所有參與者均簽署知情同意書，并且經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準。

1.2方法

1.2.1血清采集及存放 清晨釆集三組5 ml空腹靜脈血，室溫下靜置60 min進行低溫離心，收集上清液分裝在0.6 ml無酶管中，編號后，放于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2血清miR-125a的mRNA提取（TRIZOL法） 由于血清中尚無穩(wěn)定及豐富表達的基因作內(nèi)參，參照文獻[8-9]的方法具體如下。①室溫下融化血清，混勻后進行離心，將250 μl血清轉(zhuǎn)移新到新的2 ml無酶管中之后加入20 nmol cel-mir393p（百奧斯生物科技有限公司，編號：BA0440），混勻。②加500 μl TRIZOL（Bio-Rad）（上海聯(lián)碩生物科技有限公司，批號：15596026），混勻，室溫靜置10 min，離心10 min，取上清液體轉(zhuǎn)移入新EP管。③加200 μl氯仿，劇烈振蕩，時間為30～60 s，隨后需要室溫放置3 min，低溫離心10 min（4℃，12 000 r/min）；小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移到干凈的離心管中，加0.5倍的無水乙醇，混勻。④過濾后吸附柱直接放入收集管中，將③步驟的液體直接轉(zhuǎn)移到吸附柱中，靜置大約5 min，低溫離心，離心5 min（4℃，12 000 r/min）。⑤倒掉收集管中的過濾液，在吸附柱中加入500 μl PRE溶液，稀釋，靜置2 min，常溫離心30 s（12 000 r/min），倒掉收集管中的廢液，并重復(fù)此步驟一次。⑥吸附柱合上收集管一起采用離心機低溫離心2 min（4℃，12 000 r/min）。將吸附柱轉(zhuǎn)移到新的無酶管中，在吸附柱中央吸附膜處直接加入無酶水40 μl（注意全部浸濕中央吸附膜），靜置5 min，低溫離心機離心2 min（4℃，12 000 r/min）。管中有溶解RNA的溶液，編號后直接放入-20℃冰箱進行保存，方便開展后續(xù)試驗。

1.2.3血清miR-125a的mRNA逆轉(zhuǎn)錄 本研究可在生物信息網(wǎng)站查得待擴增的mRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的基因序列，利用Oligo 6引物設(shè)計軟件設(shè)計上下游引物（即在3′端增加堿基）。按照TaKaRa公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海善然生物科技有限公司，批號：RR037A）說明書進行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。

1.2.4實時定量PCR法檢測血清miR-125a ①應(yīng)用Takara公司的SYBR Premix Ex Taq產(chǎn)品進行實時PCR反應(yīng)；②進行PCR反應(yīng)，程序如下：95℃，30 s；95℃，5 s；60℃，34 s（收集熒光）；40個循環(huán)；按照這個反應(yīng)程序建立熔解曲線。以cel-mir39作為內(nèi)參，通過2-ΔΔCT法計算目標mRNA表達水平的差異。其中ΔΔCt=ΔCt（實驗樣品）-ΔCt（基準樣品），ΔCt（實驗樣本）=Ct（目的基因）-Ct（內(nèi)參基因），ΔCt（基準樣品）=Ct（目的基因）-Ct（內(nèi)參基因），2-ΔΔCt=2-（-1.2）=2.30[8-9]。

1.2.5劃痕實驗檢測細胞遷移能力 ①細胞培養(yǎng)、處理：選取生長期穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞，進行胰酶消化后，在常溫狀態(tài)下進行離心，并接種于孔板中，放置在溫育箱內(nèi)進行孵育；②實驗：在光鏡下對細胞進行觀察，待選取細胞完全長滿孔后，將直尺架于各孔板間，使用10 μl槍頭垂直于孔板底部進行劃痕，3條痕跡/孔。對各孔進行清洗，棄含有脫落細胞的清洗液。將選取細胞治愈光鏡下取圖拍照，每孔選擇5個固定部位，對劃痕進行測量。測量完畢將孔板繼續(xù)放置于溫育箱內(nèi)，1、2 d后重復(fù)清洗步驟，獲取劃痕平均值。

1.3觀察指標

對三組血清miR-125a的mRNA表達水平進行評估，并觀察ROC曲線，ROC曲線是以真陽性率為縱坐標，假陽性率為橫坐標繪制的曲線，可比較不同診斷試驗對疾病的識別能力。在光鏡下對劃痕寬度進行測量，計算細胞間距離求取均值，計算三組的創(chuàng)面愈合率，通過創(chuàng)面愈合率判斷細胞的遷移能力。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1三組血清miR-125a mRNA表達水平的比較

COPD組血清miR-125a的mRNA表達水平明顯低于重度吸煙組，重度吸煙組血清miR-125a的mRNA表達水平顯著低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

2.2三組血清miR-125a mRNA表達水平的ROC曲線

重度吸煙組ROC曲線下的面積大于COPD組，COPD組ROC曲線下的面積大于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖1）。

2.3三組創(chuàng)面愈合率的比較

重度吸煙組、COPD組的創(chuàng)面愈合率均低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表2）。

3討論

COPD的病理機制目前尚不清楚，但研究發(fā)現(xiàn)引發(fā)COPD的原因較多，常見炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、蛋白酶抗蛋白酶失調(diào)、自身免疫失常等[10-11]。研究表明，多種疾病均可導(dǎo)致miR-125a的mRNA表達水平下降，mRNA除可上調(diào)STAT3、IFNγ和IL13表達，還可打破調(diào)節(jié)性T細胞介導(dǎo)的免疫平衡[12-13]。

研究表明，在COPD患者中，吸煙導(dǎo)致COPD加重的原因主要與機體氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)[14]，氧化應(yīng)激反應(yīng)可對機體氣道和肺組織產(chǎn)生直接的損害，加速炎癥反應(yīng)。本研究人群中嚴重吸煙者的血清miR-125a的mRNA表達水平更低。研究表明，吸煙可致氧化應(yīng)激水平失調(diào)，加速炎癥水平，增加疾病進展[15]。因此吸煙作為COPD的高危因素，加速疾病進展的同時，使患者外周血清miR-125a的mRNA表達水平下降，其具體機制尚需要進一步的研究。

ROC曲線是以真陽性率為縱坐標，假陽性率為橫坐標繪制的曲線，可比較不同診斷試驗對疾病的識別能力。本研究結(jié)果顯示，重度吸煙組ROC曲線下的面積大于COPD組，COPD組ROC曲線下的面積大于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），提示重度吸煙組血清mRNA的表達水平作為COPD疾病生物標志物具有早期診斷的價值，值得臨床推廣應(yīng)用[14-16]。劃痕實驗結(jié)果顯示，血清miR-125a的mRNA表達水平越高，細胞遷移能力越快。因此miR-125a的mRNA表達水平可作為檢測COPD患者的重要依據(jù)，但血清mRNA可同時靶向多個基因組分，對機體各通路的調(diào)控較為復(fù)雜，要在研究中明確mRNA與各細胞的具體發(fā)展機制和完整的靶向通路，需進一步進行深入研究。COPD組血清miR-125a的mRNA表達水平明顯低于重度吸煙組，重度吸煙組血清miR-125a的mRNA表達水平顯著低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在進行檢查中，心肌細胞內(nèi)含有各種抗體組分，且COPD患者在發(fā)病過程中，心臟功能出現(xiàn)明顯變化，隨著COPD患者病情的加重，miR-125a的mRNA表達水平明顯降低，進一步提示miR-125a的mRNA表達水平在COPD患者診斷中的價值[17-18]。

綜上所述，相對于健康人群，COPD患者和重度吸煙高危患者中外周血清miR-125a的mRNA表達水平均下降，提示疾病早期存在血清miR-125a的mRNA表達水平異常。且吸煙可加速疾病進展，導(dǎo)致外周血清miR-125a的mRNA表達水平下降。經(jīng)過ROC曲線的敏感性和特異性分析，外周血清miR-125a的mRNA表達水平作為生物標志物在重度吸煙的高?；颊呔鶅?yōu)于COPD患者和健康者，提示可將血清miR-125a作為COPD早期診斷的生物標志物，為疾病預(yù)防和阻止進展提供依據(jù)。

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（收稿日期：2018-09-05 本文編輯：任秀蘭）