牛病毒性腹瀉病診斷技術研究進展

李新紅

牛病毒性腹瀉病主要癥狀為呼吸系統疾病、生殖系統疾病、胃腸道疾病，降低牛群的生產力和經濟活動，最后是免疫抑制癥狀。本文綜述了牛病毒性腹瀉的現狀及現有的診斷技術，以期為牛病毒性腹瀉防治研究提供理論依據。

1 BVDV的分離和鑒定

BVDV的傳播渠道多樣，一般通過牛的腔道分泌物、血液、脾臟淋巴結和腸系膜淋巴結進行傳播，胎牛腎細胞和小牛睪丸細胞接種進行分離鑒定。

2 血清學診斷

2.1 中和試驗

在實驗室常被研究人員采用，它可有效診斷牛病毒性腹瀉疾病和黏膜相關疾病。于前3～4周采集病牛血液兩次，血清稀釋。如果第二次的效價高于第一次的效價的2倍以上可以確定為疑似疾病，4倍以上可以確定為陽性。但該方法也存在一定的診斷局限性，檢測到的病牛為陰性時，此牛可能為免疫耐受。因此，若要準確、高效診斷群體牛病毒性腹瀉病還要結合其它有效方法。

2.2 免疫瓊脂擴散法

簡單可行，易于養殖場實驗人員操作。通常選擇潰瘍或炎癥組織周圍的黏膜直接與BVDV陽性血清反應，檢測抗原。用標準陽性抗原檢測患病動物的血清也是可取的，但靈敏度低于中和試驗。陳茂生等采用該方法檢測BVDV抗體，并與微量中和試驗進行比較。國外學者也得出了同樣的結論，在檢測牛病毒性腹瀉病免疫瓊脂擴散法不能替代中和試驗方法。

2.3 蛋白A膠體金免疫電鏡法

快速、簡便，可直接用于病原體或細胞的鑒定，觀察病毒顆粒的形態。然而，它容易受到類似病毒粒子的干擾，特異性和敏感性低。觀察病毒顆粒本身是很困難的，需要107個病毒/毫升以上。

2.4 免疫過氧化物酶法

準確可靠，是診斷牛病毒性腹瀉病常用方法。目前，此方法已廣泛應用于抗原的分布和抗體檢測。在該方法中，感染BVDV的細胞通過檢測單層細胞培養濃縮，且感染BVDV的細胞是無色的。現有研究發現，將用生物素標記的抗小鼠抗體-鏈霉素抗生素蛋白連接的過氧化物酶檢測系統與單克隆抗體相結合可以有效提高檢測的特異性與精確度。

2.5 免疫熒光技術

一種新型技術，它將免疫的特異性、敏感性和顯微技術相互結合起來運用，能夠快速地檢測到病理組織中的病毒顆粒和受感染細胞培養物。

2.6 酶聯免疫吸附實驗（ELISA方法）

一種很好的檢測方法，在BVDV檢測方面，可很好地檢測BVDV的抗體水平。利用抗原抗體特異性結合的原理，ELISA方法的檢測靈敏度高，特異性強，檢測準確率好。

3 BVDV的分子生物學檢測技術

3.1 核酸擴增技術

隨著分子生物學檢測技術在牛病毒性腹瀉病診斷中的應用，核酸擴增技術已廣泛應用于實驗室診斷。在診斷牛病毒性腹瀉疾病時，主要的方法有體外循環（LAMP）等溫擴增、一步RT-PCR、雙RT-PCR、嵌套RT-PCR、實時熒光定量RT-PCR等。這些技術可以區分不同基因型的BVDV菌株，從分子水平上檢測BVDV，具有簡單、快速、靈敏度高、特異性強等特點。

3.2 核酸探針雜交

核酸探針雜交技術應用廣泛，相比傳統的方法靈敏度高，特異性強。早期主要運用放射性同位素探頭，有放射性危害，而且穩定性不足。后來人們研制出來用生物素標記的DNA探針，這種探針沒有放射性危害，然而其特異性沒有放射性同位素標記探針好。

4 小結

牛病毒性腹瀉在世界范圍內一直廣泛的傳播，目前還無研究出有效的治療方法和高效的免疫方法，只有不斷改善對牛群的護理工作和加強有效對癥治療，增強牛群機體抵抗疾病的力，促進病牛的機體康復與痊愈。為了預防繼發感染，目前我國已成功研制生產可以接種不同年齡和品種牛的減毒凍干疫苗。接種疫苗后，牛在14天之后可以產生抗體并具有兩年的免疫期。國外許多學者也致力于牛病毒性腹瀉病毒致病機制以及疫苗的研究，特別是E0和E2的研究，為診斷牛病毒性腹瀉病技術的革新及新型疫苗的開發奠定了堅實的基礎。