豬繁殖與呼吸綜合征病毒不同毒株鑒別檢測方法研究進(jìn)展

趙澤強(qiáng)

摘要：本文就當(dāng)前我國豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）不同毒株鑒別檢測方法的研究與應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述，對提升我國豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）的綜合防控能力具有一定的參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征病毒;不同毒株;鑒別檢測

豬繁殖與呼吸綜合征病毒具有歐洲型和美洲型兩個基因型，歐洲型毒株一般不引起嚴(yán)重的臨床癥狀，但易導(dǎo)致混合感染，美洲型毒株可引起嚴(yán)重的臨床癥狀以及感染豬的大批量死亡。自1995年開始美洲型PRRSV在我國開始流行，流行期間不斷發(fā)生變異，2006年以JXA1毒株為代表的高致病性美洲型PRRSV在我國開始流行，高致病性PRRSV的致病性方面發(fā)生了很大變化，引起來了豬群的大批量死亡，雖然短時(shí)間內(nèi)即開發(fā)出了相應(yīng)的商品化疫苗，但一直未能完全控制高致病性PRRSV的流行，2013年以來，一種致病性介于經(jīng)典株與高致病性毒株之間的美洲型PRRSV開始流行，由于該毒株與美國NADC30毒株的同源性很高，因此被稱為NADC30-like毒株，2011年我國又發(fā)現(xiàn)了歐洲型PRRSV感染的病例。目前，我國PRRSV的流行毒株仍以美洲型為主，但經(jīng)典株、高致病性株、NADC30-like毒株并存，同時(shí)歐洲型的感染時(shí)有發(fā)生，使PRRSV的鑒別診斷和防治難度加劇。本文綜述了PRRSV不同毒株鑒別檢測方法的研究與應(yīng)用進(jìn)展，為提升我國PRRSV的綜合防控能力提供參考。

1 RT-PCR方法

RT-PCR方法靈敏、特異、快速、簡便，是最常用的分子生物學(xué)診斷技術(shù)。李冰等建立了能夠同時(shí)鑒別檢測美洲型經(jīng)典株、變異株和歐洲型毒株的多重PCR方法，該方法可對經(jīng)典株、高致病性株、歐洲型毒株分別擴(kuò)增出466bp、376bp、580bp的特異性片段。孟令宅等建立了檢測PRRSV經(jīng)典株、高致病性株、NADC30-like株3種毒株RT-PCR鑒別檢測方法，該方法可對經(jīng)典株、高致病性株、NADC30-like株分別擴(kuò)增出1072bp、985bp、682bp的特異性片段，而擴(kuò)增豬瘟病毒、偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型均為陰性，對經(jīng)典株、高致病性株、NADC30-like株的最低核酸檢出量分別為385皮克、269皮克、402皮克。RT-PCR方法快速、簡單、準(zhǔn)確、敏感，可用于不同PRRSV毒株的臨床快速鑒別檢測和流行病學(xué)調(diào)查。

2 熒光定量RT-PCR方法

熒光定量RT-PCR方法將光譜技術(shù)引入到常規(guī)RT-PCR方法中，在RT-PCR反應(yīng)過程中實(shí)現(xiàn)了對拷貝數(shù)的準(zhǔn)確定量。李曉菲等建立了一種可同時(shí)鑒別檢測PRRSV經(jīng)典株、高致病性株、NADC30-like株的TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR方法，該方法最低可以檢測到10-1拷貝/μL的核酸，敏感性是常規(guī)RT-PCR方法的100倍，重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)小于2.34%。熒光定量RT-PCR方法的敏感性更高、特異性更強(qiáng)、重復(fù)性更好，為我國PRRSV的實(shí)驗(yàn)室鑒別診斷、流行病學(xué)調(diào)查提供了準(zhǔn)確、

敏感、快速的檢測手段。

3 基因芯片方法

基因芯片是將特異性核酸雜交技術(shù)引入到PCR方法中，通過雜交信號的強(qiáng)弱即可判定目的基因的有無。郭煥成等根據(jù)PRRSV經(jīng)典毒株與高致病性毒株的核苷酸序列分別設(shè)計(jì)引物和探針，建立了鑒別檢測PRRSV經(jīng)典株與變異株的基因芯片方法。該方法通過雜交模式可區(qū)分PRRSV經(jīng)典株與高致病性株，與常規(guī)PCR法的靈敏度相近，對12份臨床病料的檢測結(jié)果與常規(guī)PCR方法的檢測結(jié)果完全一致。基因芯片方法高通量、自動化，可通過集成PRRSV不同毒株的基因探針來實(shí)現(xiàn)快速鑒別診斷，可用于PRRSV的臨床鑒別診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

4 環(huán)介導(dǎo)間接PCR方法

環(huán)介導(dǎo)間接PCR是在一段報(bào)告基因的首尾兩端分別連接兩段特異性探針，再采用反向PCR擴(kuò)增含探針的報(bào)告基因而實(shí)現(xiàn)對病原體的間接檢測。鄭鳴等選擇大豆Lectin基因作為報(bào)告基因，將設(shè)計(jì)合成的2對PRRSV特異性探針分別標(biāo)記于Lectin基因的兩端，建立了鑒別檢測PRRSV經(jīng)典株和高致病性株的環(huán)介導(dǎo)間接PCR方法，該方法可對PRRSV經(jīng)典株和高致病性株的最低檢測靈敏度分別為5.6TCID50/毫升和18TCID50/毫升，該方法檢測20份臨床樣本，檢測出PRRSV經(jīng)典株陽性樣品4份，PRRSV高致病性陽性樣品9份，混合感染樣品1份，與常規(guī)PCR的檢測結(jié)果完全一致。

5 結(jié)語

PRRSV一直以來都是困擾我國養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要免疫抑制病之一，加強(qiáng)PRRSV不同毒株的快速鑒別診斷對預(yù)防和控制PRRS具有重要的現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義。其中RT-PCR方法只需要簡單的儀器設(shè)備和試劑，適合一般實(shí)驗(yàn)室使用。熒光定量RT-PCR方法對儀器設(shè)備、試劑以及人員技術(shù)水平要求均較高，具有試驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)室可選擇使用。基因芯片方法和環(huán)介導(dǎo)間接PCR方法尚處于摸索階段，一般實(shí)驗(yàn)室因不具備試驗(yàn)條件而無法開展。相信隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展及在動物疫病診斷中的廣泛應(yīng)用，PRRSV不同毒株的鑒別檢測方法將會得到進(jìn)一步成熟與完善，不斷為我國PRRSV的綜合防控提供技術(shù)保障。