7株野生香菇菌株的特性及出菇試驗*

馬 宏，張根偉，劉 萌，劉昆昂，李書生，尹淑麗，劉振國，付艷菊

（河北省科學院生物研究所，河北 石家莊 050081）

香菇（Lentinus edodesBerk.Pegler），又名香蕈、香信等，是一種著名的食藥兼用菌[1］。我國地域遼闊，大部分地區均有野生香菇的分布，是全球香菇種質資源最豐富、遺傳多樣性最高的區域[2-3］，但是在栽培品種的遺傳種質資源中利用的卻相對較少。野生香菇的研究、開發和利用，充分挖掘野生香菇的優良品質，對香菇的育種工作將產生較大的促進作用。

浙江龍泉屬亞熱帶季風氣候區，其海拔最高的鳳陽山，現記錄有食用真菌95種，是人類最早認知香菇、馴化香菇的貢獻地[4］。本研究在鳳陽山采集了14株野生香菇菌株，通過拮抗實驗確定了7株菌株。ITS鑒定7株菌株為香菇菌株，并進行了菌絲生長速度、木質素酶活性纖維素酶活性、抗木霉能力、出菇情況的試驗，為野生香菇的開發利用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

2017年3月，在浙江龍泉市鳳陽山進行了野生香菇采集、分離，得到14個野生香菇子實體，并進行了菌株分離。經拮抗試驗，初步鑒定7株為野生香菇菌株（Lentinula edodes），命名為野香1（YS1）、野香2（YS2）、野香3（YS3）、野香4（YS4）、野香5（YS5）、野香 6（YS6） 和野香 7（YS7）。對照菌株為靈仙1號，硬質、中早熟、中型菇。

1.2 培養基

改良PDA培養基:馬鈴薯20%、葡萄糖2%、木屑粉1%、磷酸二氫鉀0.3%、硫酸鎂0.15%、蛋白胨0.2%、瓊脂1.2%，pH自然；木屑栽培袋配方:木屑78%、麩皮20%、蔗糖1%、CaCO31%，含水量62%，pH自然；出菇栽培料配方:雜木屑85%、麩皮15%，pH自然；木質素酶顯色培養基:梨木屑1%煮汁、愈創木酚0.02%、瓊脂1.2%；纖維素酶顯色培養基:微晶纖維素0.2%、剛果紅0.02%、瓊脂1.2%。

1.3 香菇菌株的DNA提取和ITS分子鑒定

1.3.1 基因組 DNA 的提取

25℃條件下，野生香菇菌株在PDA培養基上培養20 d，稱取菌絲0.5 g液氮研磨，基因組DNA采用試劑盒提取，具體方法見天根生化科技（北京）有限公司“植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）”使用說明書。

1.3.2 ITS-PCR 擴增

采用真菌ITS序列通用引物[5］ITS1（5’-TCCG TAGGTGAACCTGCGG-3’） 和 ITS4 （5’-TCCTC CGCTTATTGATATGC-3’） 對樣品進行擴增。PCR反應體系 （50 μL）:5 μL 10×PCR Buffer、4 μL dNTP、引物（10 μmol·L-1）各1 μL、1 μL Taq DNA聚合酶、2 μL DNA模板，用水補至50 μL。PCR擴增條件:94℃預變性2 min，94℃變性40 s，52℃復性1 min，72℃延伸 1 min，共 35個循環，72℃保溫 5 min，4℃保存。將PCR產物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

PCR產物經純化后連接于pEASY-T3載體，挑選陽性克隆送到北京六合華大基因科技有限公司測序。純化和連接分別按EasyPure PCR Purification Kit試劑盒和pEASY-T3 Cloning Vector（TRANS） 試劑盒說明書操作。

1.3.3 DNA序列比對和系統發育樹的構建

測序獲得的rDNA ITS序列使用GenBank中的BLAST工具軟件進行同源DNA序列搜索比對。利用MEGA 6.0軟件構建NJ系統發育樹，使用靴帶自檢法檢驗（bootstrap）發育樹1 000次，以此來判斷各處的可信度。

1.4 菌絲生長試驗

PDA試管試驗:用打孔器取直徑5 mm的菌餅，接種到3個改良PDA培養基試管，25℃恒溫培養，3 d后每隔12 h測量、記錄菌絲生長速度，連續記錄10次。菌絲長滿試管后，依據菌絲生長濃密程度，將對照菌株的菌絲密度用“＋＋＋”表示，野生菌株與對照菌株相比，“＋”號越多，表明菌絲生長越濃密，所有觀察均在無菌條件下進行。

木屑栽培袋試驗:用打孔器取直徑5 mm的菌餅，接種到5個木屑栽培袋，25℃恒溫培養，3 d后每隔12 h測量、記錄菌絲生長速度，連續記錄10次。菌絲長滿木屑栽培袋后記錄滿袋時間。

1.5 木質素酶活性和纖維素酶活性測定

利用變色圈法測定木質素酶活性和纖維素酶活性。用打孔器取直徑5 mm的菌餅，接入顯色培養基中，分別在5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃培養3 d，測定變色圈直徑[6］。

1.6 抗木霉能力試驗

使用直徑90 mm的培養皿，每皿用定量蠕動泵定量加入35 mL PDA培養基。用直徑為0.5 cm的打孔器打孔制備供試菌株菌餅，接種到距離培養皿中心2.5 cm處，25℃培養4 d，對稱的接入木霉菌餅，在25℃條件下培養3 d。測量香菇菌株菌落生長半徑、抑制帶寬度，并且持續觀察抑制帶的顏色、大小變化。相對抑菌能力（P，%）公式為:

式中:R表示供試菌株菌落半徑；R0表示對照菌株（靈仙1號）菌落半徑。

1.7 出菇試驗

2017年7月25日，采用聚丙烯塑料袋（17 cm×33 cm） 裝料，每袋約裝干料1 000 g。高溫滅菌（115℃） 8 h，待料溫降至25℃以下，按無菌操作規程4穴接種，各接100袋，常規管理，轉色完成后噴水、保濕出菇。觀察出菇情況，并記錄滿袋時間、出菇期、出菇溫度、菌蓋的厚度和直徑、菌柄的柄長和柄粗。

1.8 統計方法

所有試驗數據利用Excel2007中AVERAGE和STDEVP函數計算樣本的均值和標準差，利用SPSS 17.0軟件中LSD進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 野生香菇菌株的ITS鑒定

利用BLAST工具軟件比對發現，測序結果與香菇的序列相似性為99%以上，表明分離到的菌株為香菇。根據楊瑞恒等[2］的研究結果，Blast比對的結果全部集中在Ⅰa和Ⅰb分支中，為了確定分離到的7株野生香菇是否具有差異性，根據分支、菌株來源以及Blast比對結果的覆蓋率，在Ⅰa和Ⅰb分支中各選取了4個野生香菇菌株。同時，選取了香菇栽培菌株L9和金針菇菌株F-1450（Flammulina velutipesF-1450） 共同建樹分析，如表1所示。基于ITS序列構建野生香菇菌株的NJ系統發育樹見圖1。

表1 構建系統發育樹所用菌株Tab.1 Strains used for phylogenetic trees

如圖1所示，選取的8個野生香菇菌株與楊瑞恒等[2］的研究結果一致，分為了2個分支，香菇栽培菌株L9分布在Ⅰa分支，與LMLHA25親緣關系最近，菌株YS6分布在Ⅰb分支，與SHX006親緣關系最近。其他6株野生香菇菌株既沒有分布在Ⅰa和Ⅰb分支，也沒有形成一個大的分支，親緣關系逐級遞增，菌株YS3與其他菌株親緣關系最遠。Flammulina velutipesF-1450作為外圍，與上述7個野生香菇菌株親緣關系最遠。說明分離到的7株野生香菇菌株與已報到的野生香菇菌株具有遺傳差異性。

圖1 基于ITS序列構建野生香菇菌株的NJ系統發育樹Fig.1 Construction of NJ phylogenetic tree of wild Lentinus edodes strain based on ITS sequence

2.2 野生香菇菌株菌絲生長特性

分別測定在PDA試管和木屑栽培袋中栽培的菌株的菌絲生長情況，結果如表2所示。

表2 野生香菇菌株菌絲生長特性Tab.2 Growth characteristics of wild Lentinus edodes mycelium

表2結果表明，野生香菇菌株菌絲在試管中的生長速度以及在栽培袋中的生長速度和滿袋時間，都顯著地高于對照菌株靈仙1號。對7個野生香菇菌株比較發現，菌株YS1的菌絲生長速度最快，菌絲濃密，菌株YS3的菌絲生長速度最慢，菌絲較稀疏。

2.3 野生香菇菌株菌絲的酶活特性

2.3.1 木質素酶活性

以愈創木酚為底物，在定量培養皿中測定不同溫度時的變色反應圈，以表示木質素酶活性，結果見圖2。

圖2 野生香菇菌株菌絲不同溫度下的木質素酶活性Fig.2 Lignin enzyme activity of wild Lentinus edodes mycelium at different temperatures

圖2結果表明，5℃～15℃低溫條件下，菌株YS3、YS4、YS5、YS6的木質素酶活性均顯著高于對照菌株靈仙1號，酶活性由高到低依次為菌株YS4、YS5、YS6、YS3。20℃～30℃高溫條件下，菌株 YS4、YS7的木質素酶活性均顯著高于靈仙1號。總體上看，菌株YS4和YS7的木質素酶活性要優于靈仙1號。

2.3.2 纖維素酶活性

以微晶纖維素為底物，剛果紅染色，在定量培養皿中測定不同溫度時的變色反應圈，以表示纖維素酶活性，結果見圖3。

圖3 野生香菇菌株菌絲不同溫度下的纖維素酶活Fig.3 Cellulase activity of wild Lentinus edodes mycelium at different temperatures

圖3結果表明，低溫和高溫條件下纖維素酶活性均顯著高于對照菌株的菌株有YS7、YS5、YS6、YS3。其中，5℃～15℃低溫條件下，纖維素酶活性最高的是菌株YS7；20℃～30℃高溫條件下，纖維素酶活性最高的是菌株YS5。菌株YS5和YS7表現出較高的纖維素酶活特性。

2.4 野生香菇菌株菌絲抗木霉能力特性

抗木霉的能力通過拮抗試驗進行確定，即測量香菇菌株和木霉的菌落半徑，計算抑菌能力，觀察2個菌落交接處抑制帶寬度和顏色。具體結果見表3。

表3 野生香菇菌株的抗木霉能力Tab.3 Anti Trichoderma ability of wild Lentinus edodes strain

菌株YS1、YS2、YS3和YS6抗木霉的抑菌能力顯著高于對照菌株靈仙1號，提高20%以上。綜合比較抑制帶寬度和顏色，菌株YS1、YS2、YS4、YS5和YS6的抑制帶窄、顏色深，抗木霉能力顯著強于菌株808和靈仙1號。

2.5 野生香菇菌株出菇試驗

野生香菇菌株出菇試驗結果見表4。

如表4所示，只有菌株YS4、YS5、YS6能夠出菇，均為小型菇。菌株YS5中間有明顯凸起，而且在12月份依然出菇，說明菌株YS5耐低溫。其他菌株直到12月底依然不能出菇，可能因為這些菌株是晚熟品種或者有病毒感染，也可能是出菇條件不合適，目前具體原因不明。

表4 野生香菇出菇試驗結果Tab.4 Wild Letinous edodes mushroom test results

3 結論

種質資源作為基礎生產資料，對食用菌的產量、質量以及銷量起著關鍵的作用。比如，河北省平泉縣利用科技力量栽培的錯季香菇，產量居全國單品第一[7-8］。

本研究采集分離的7株野生香菇栽培，在分子水平和菌株特性方面都具有遺傳差異性。利用ITS序列構建的NJ系統發育樹，7株野生香菇沒有聚為一支。在菌株的特性和出菇試驗中，菌株YS1的菌絲生長最快，菌株YS7的木質素酶活性和纖維素酶活性都相對較高，菌株YS2的抗木霉能力強，菌株YS5出菇耐低溫。此外，本研究結果說明，自然條件下，野生香菇孢子通過風力與野生香菇菌絲進行單單或單雙雜交，大量收集同一地區的野生香菇菌株，也能獲得具有特異性的優良種質資源[9］。

之前的研究結果表明中國大陸的香菇分成譜系I和譜系V[2-3，10-11］，譜系I聚集了多數的香菇（Lentinus edodes）菌株。本研究選取了部分已報道的野生香菇菌株與分離到的7株野生香菇菌株，利用Neighbor-Joining構建系統發育樹，只有菌株YS6分布在Ⅰb分支中。添加譜系Ⅱ～Ⅳ和譜系Ⅵ～Ⅷ中的野生香菇菌株構建系統發育樹，其余6株野生香菇菌株也未分布在Ib分支中（數據略），說明這六株野生香菇菌株與已報道的野生香菇菌株具有一定的遺傳差異性，可以為野生香菇的遺傳譜系研究提供參考。