氣質聯用結合多變量分析研究蜂蜜的揮發性成分

王文靜，周雅蓮，薛阿輝，屈亮亮，黃學勇*，羅麗萍,2

1南昌大學生命科學學院，南昌 330031；2南昌大學，食品科學與技術國家重點實驗室，南昌 330047

蜂蜜是由蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物混合后，經充分釀造而成的天然甜性物質[1]。不同來源蜂蜜的共性成分主要是糖類(70%～80% w/w)和水(10%～20% w/w)[2]，而蜂蜜產品的特殊性即風味、香味、顏色和質地主要取決于花蜜或植物的種類[3]。根據蜜源植物不同，蜂蜜分為單花蜜和雜花蜜[4]。單花蜜具有天然的特性和功效，在市場上廣受消費者歡迎[5]。由于蜜源豐富，油菜蜜是穩產高產的蜂蜜品種之一，大約占蜂蜜總產量的40%左右。此外，椴樹蜜、荊條蜜和洋槐蜜也是我國主要的蜂蜜品種，因蜜源來源限制，價格也高于油菜蜜。受高額利潤的驅使，不法商家往往以次充好，通過摻入油菜蜜形成勾兌蜜，或用雜花蜜冒充單花蜜，欺騙消費者，這不僅降低了蜂蜜的質量，也嚴重干擾了蜂產品市場秩序[6-8]。為保障蜂蜜產品質量和市場秩序，需進行溯源技術體系的研究[9]。

蜂蜜的氣味與蜜源關系密切，不同植物花蜜中揮發性物質的種類和含量不同，造成不同蜂蜜不同的氣味特征，研究蜂蜜中的揮發性化合物對蜂蜜種類鑒別具有積極意義[10-13]。Alissandrakis等[14]認為某種化合物存在于所檢測的所有單花蜜中，且不存在于其他蜂蜜或存在但含量較少時，該化合物可被看作該單花蜜的特征性化合物。Radovic等[15]采用動態頂空氣相色譜-質譜聯用技術分析了9種不同植物源的43個蜂蜜樣品，認為存在二甲基二硫和同時不存在2-甲基-1-丙醇是歐洲油菜蜜植物源標記物；順式芳樟醇和庚醛可作為洋槐蜜的標記物。然而，Plutowska[16]等采用頂空固相微萃取的氣相色譜-質譜聯用技術研究了波蘭不同植物源蜂蜜發現二甲基二硫并非油菜蜂蜜的特有物質。Ka?koniene等[17]從11個油菜蜜中的6個樣品中檢出了二甲基二硫，但均未檢出2-甲基-1-丙醇。由于單花蜜的揮發性物質和植物蜜源以及生存環境相關，一些揮發性物質可能存在于或不存在于同種蜜源中，但其出現頻率比較高，在其它蜂蜜中未檢出或含量較低時，也應將它確定為單花蜜的特征性揮發物[18]。大量研究表明，受內外因素的作用均會影響蜂蜜的化學組成，因此利用多種化合物和多元統計方法應更準確的鑒別不同蜜源蜂蜜[19 ]。

本文以油菜蜜、椴樹蜜、荊條蜜和洋槐蜜為實驗材料，采用靜態頂空氣相色譜-質譜聯用技術(static headspace-gas chromatography-mass spectrometry,SHS-GC-MS)對其中的揮發性化合物組成進行鑒別，進一步采用主成分分析(principal component analysis,PCA)和聚類分析(cluster analysis,CA)等多變量分析方法，對4種蜂蜜進行統計區分，并尋找特征變量和探討它們的典型代謝物質，以期為蜂蜜溯源、品質和真偽鑒別提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜂蜜：共收集了4種蜜源的38份蜂蜜樣品，具體信息見表1。樣品由各地蜂農提供，4 ℃保存備用。C8-C40正構烷烴混標(美國AccuStandard公司)；正己烷(天津市大茂化學試劑廠，分析純)。

表1 蜂蜜樣品信息表

1.2 儀器與設備

GC7890B-MS7000C氣相色譜-質譜聯用儀，配置7697A頂空進樣器(美國Agilent公司)、HP-5ms色譜柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；BSA224S型電子天平(賽多利斯科學儀器北京有限公司)；DKZ-450B型電熱恒溫振蕩水槽(上海森信實驗儀器有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 SHS-GC-MS實驗條件的優化

參考Kaskoniene和Siegmund等[17,21]的報道，對影響SHS-GC-MS檢測結果的主要因素，包括平衡時間、平衡溫度、樣品量、分流比等進行了優化，以匹配度>75%的有效峰個數為評價指標，獲得最佳實驗條件。

1.3.2 SHS-GC-MS檢測蜂蜜中的揮發性成分

將待測蜂蜜樣品置于45 ℃水浴中加熱20 min，混勻樣品，準確稱取13.00 g蜂蜜加入20 mL頂空瓶中，壓緊瓶蓋密封，置于樣品盤。正構烷烴標準品用正己烷稀釋至1 mg/mL待測。

頂空瓶加熱溫度80 ℃，樣品平衡20 min，定量環溫度100 ℃，傳輸管溫度120 ℃，進樣環體積1 mL，進樣時間1 min。

GC條件：氣化室溫度250 ℃，柱溫為初始溫度40 ℃(保持2 min)，以8 ℃/min升溫至250 ℃，分流模式進樣，分流比5∶1，氮氣流速1 mL/min。MS條件：EI電離方式，電子能量為70 eV，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，質譜掃描模式定性，掃描范圍m/z30～500，溶劑延遲1.5 min。

1.4 數據分析

分離的揮發性化合物的鑒定通過儀器自帶的NIST14和Flavor4數據庫檢索，結合正構烷烴標準品計算保留指數(Kova’ts retention indices,KI)，并與質譜庫中的保留指數比對進行定性分析。峰面積歸一法獲得各揮發性成分的相對含量。使用Matlab R2016a(美國Mathworks公司)和SPSS 22.0(IBM SPSS statistics)軟件對數據進行主成分分析(PCA)和聚類分析(CA)。

2 結果與分析

2.1 SHS-GC-MS實驗條件的優化結果

為獲得更豐富的揮發性物質，本文對樣品量(2.00、7.00、13.00 g)、平衡時間(10、20、30 min)、平衡溫度(60、70、80 ℃)、分流比(不分流、5∶1、10∶1)進行了對比優化，比較結果如圖1所示。結果表明，平衡時間20 min，平衡溫度80 ℃，樣品量取13.00 g和分流比為5∶1時獲得匹配度>75%的色譜峰數目最多。

圖1 不同實驗條件對蜂蜜揮發性成分色譜峰數目的影響Fig.1 Effects of different experimental conditions on the number of peaks of volatile components in honey

2.2 蜂蜜揮發性成分的SHS-GC-MS分析

利用SHS-GC-MS從38份蜂蜜樣品中檢測到23種化合物(見表2)。不同蜜源蜂蜜物質組成和相對含量之間存在差異。 4種蜂蜜中都檢出了苯乙醛(38個樣品中有19個樣品檢出)和鄰苯二甲酸二異丁酯(38個樣品中有25個樣品檢出)，且苯乙醛(32.72%)平均相對含量高于鄰苯二甲酸二異丁酯(5.53%)。

在17份油菜蜜中共檢測出16種揮發性物質，3-苯丙酸乙酯(14)和2-甲基丁醇(12)是在樣品中檢出較多的物質(括號中的數字表明檢出該物質的樣品數，以下同)，3-苯丙酸乙酯在其他蜂蜜中未檢出，而在油菜蜜中出現頻率比較高，可作為油菜蜜的典型代謝物，Seisonen等[20]也從產于愛沙尼亞的帚石南蜜和油菜蜜中檢出了這種物質。Siegmund等[21]的報道也同樣檢測到了乙酸、苯甲醛和苯乙醛等物質。油菜蜜中平均相對含量較高的物質依次是乙酸乙酯(56.12%)、2-甲基丁醇(10.48%)和乙酸(4.71%)。與其他幾種單花蜜相比，油菜蜜中缺乏反式玫瑰醚，脫氫芳樟醇等，這作為油菜蜜的特征之一，與文獻報道相一致[16]。

在8份椴樹蜜中共檢測出9種揮發性物質，平均相對含量較高的物質依次是1-異丙烯基-3-甲基苯(10.46%)、反式玫瑰醚(9.35%)和苯乙醇(3.31%)，其中1-異丙烯基-3-甲基苯(8)和反式玫瑰醚(6)在其他單花蜜中未檢出且頻率相對較高，可作為椴樹蜜的典型物質。裴高璞[22等的研究認為反式玫瑰醚是椴樹蜜的特有成分。

在8份荊條蜜中共檢測出12種揮發性物質，這12種物質均在其他蜂蜜中檢出，其中苯乙醛存在于所有荊條蜜中，含量高達(56.99%)，然而其他三個蜜種的11個樣品中也有檢出，因此未發現荊條蜜的典型代謝物質。

在5份洋槐蜜中共檢測出7種物質，其中鄰苯二甲酸二異丁酯和苯甲醛存在于所有洋槐蜜樣品，但前者在其他三個蜜種的20個樣品中，后者在5個荊條蜜和2個油菜蜜樣品中也有檢出，因此同樣未發現典型代謝物質。洋槐蜜中平均相對含量較高的物質依次是乙酸乙酯(24.66%)、鄰苯二甲酸二異丁酯(16.29%)和(S)-氧化芳樟醇(7.25%)。

我們還發現了部分成分僅出現在某一兩個蜂蜜樣品中，如(1S,4S,4aR)-4-異丙基-1,6-二甲基-1,2,3,4,4A,7-六氫萘(2.04%)、乙酸葉醇酯(2.45%)和辛酸乙酯(0.10%)等，且含量相對較低，可能與蜂蜜的污染或發酵等有關[23]。

表2 SHS-GC-MS檢測不同蜂蜜樣品的揮發性物質組成

續表2(Continued Tab.2)

編號No.RT化學式Chemical formula化合物CompoundsKI相對含量Relative percent(%)油菜蜜(n=17)Rape honey椴樹蜜(n=8)Linden honey荊條蜜(n=8)Chaste honey洋槐蜜(n=5)Acacia honey1310.59C10H122,4-二甲基苯乙烯a,bBenzene,1-methyl-4-(1-methylethenyl)-1 096NDND0.21～2.47 (4)ND1410.84C8H14O2乙酸葉醇酯a,b3-Hexen-1-ol,acetate,(Z)-1 1102.45 (1)NDNDND1510.86C10H16O脫氫芳樟醇a,bHotrienol1 110ND6.46～11.85 (3)1.58～6.25 (4)ND1610.98C10H18O反式玫瑰醚a,btrans-Rose oxide1 117ND3.85～24.20 (6)NDND1711.13C8H10O苯乙醇a,bBenzeneacetaldehyde1 123ND0.62～7.90 (4)0.24～0.85 (4)2.50～3.21 (2)1812.18C9H10O2苯甲酸乙酯aBenzoic acid,ethyl ester1 1930.10～0.40 (7)NDNDND1912.58C10H20O2辛酸乙酯aOctanoic acid,ethyl ester1 2010.10 (1)NDNDND2013.74C10H12O2乙酸苯乙酯a,bAcetic acid,2-phenylethyl ester1 2661.30～3.20 (8)10.88～18.60 (2)0.85～4.32 (2)ND2115.32C11H14O23-苯丙酸乙酯a,bBenzenepropanoic acid,ethyl ester1 3590.30～1.71 (14)NDNDND2219.39C15H24(1S,4S,4aR)-4-異丙基-1,6-二甲基-1,2,3,4,4A,7-六氫萘aCubenene1 6232.04 (1)ND2.05 (1)ND2322.84C16H22O4鄰苯二甲酸二異丁酯a,b1,2-Benzenedicarboxylic acid,bis(2-methylpropyl) ester1 8830.28～12.51 (11)4.02～4.44 (2)0.55～4.50 (7)0.87～26.13 (5)

注：a:GC-MS鑒定;b:NIST譜庫檢索鑒定;KI:根據正構烷烴計算的保留指數;ND:未檢測到;括號內數值為該物質檢出樣本數。

Note:a:Identification by GC-MS;b:Identification according to NIST Mass Spectral Library;KI:Kova’ts retention indices calculated by n-alkanes;ND:not detected;The value in brackets indicates the number of samples detected.

2.3 主成分分析和聚類分析

利用Matlab R2016a軟件對4種不同蜜源的38份蜂蜜樣品的氣相匹配數據進行PCA分析，計算特征值、特征向量以及累計貢獻率。 圖2(A)，2(B)是PCA 得分圖，PC1、PC2 和 PC3 分別代表了變量總方差的41.0%、20.6%和15.7%，累積貢獻率達77.3%，包含了分析樣品的絕大部分信息。圖2(C)是PCA分析相應的載荷圖，其中貢獻較大的物質有乙酸乙酯，苯乙醛，1-異丙烯基-3-甲基苯，反式玫瑰醚，鄰苯二甲酸二異丁酯，苯乙醇，脫氫芳樟醇和乙酸苯乙酯等。PCA二維圖和三維圖表明，不同蜜源之間可以很好地區分。結果表明，SHS-GC-MS結合PCA可以有效區分4種不同蜜源蜂蜜。

圖2 4種不同蜜源蜂蜜的38份蜂蜜樣品的PCA得分圖(PC-2維圖(A)、PC-3維圖(B))和載荷圖 (C)Fig.2 Score plots ( (A) principal component PC-two-dimensional,(B) PC-three-dimensional ) and loading plots (C) of 38 honey samples from 4 different honey sources by principal component analysis

利用SPSS 22.0軟件對4種不同蜜源的38份蜂蜜樣品的氣相匹配數據進行CA分析，采用平方Euclidean距離測量方法，結果如圖3所示。當臨界值為10時38份蜂蜜樣品被分為4類，不同蜜源的蜂蜜可以很好的分別各自聚為一類。聚類分析結果與PCA分析結果一致，結果表明，SHS-GC-MS結合CA的方法有效，分類正確率達到了100%。

圖3 4種不同蜜源蜂蜜的38份蜂蜜樣品的CA樹形圖Fig.3 Dendogram of 38 honey samples from 4 different honey sources by cluster analysis

3 結論

本文采用優化的SHS-GC-MS從4種蜂蜜中共鑒定出23種化合物，其中3-苯丙酸乙酯可作為油菜蜜的典型代謝物，1-異丙烯基-3-甲基苯和反式玫瑰醚可作為椴樹蜜的典型代謝物，荊條蜜和洋槐蜜未發現典型代謝物。由于蜂蜜的化學組成極其復雜，不僅受蜜源影響，同一種蜜源產地不同，甚至同一產地在不同氣象條件下，也會導致蜂蜜化學組成的變化，所以，單一的揮發性物質很難將不同蜜源的蜂蜜分開，基于多變量分析的PCA和CA有助于對不同蜜源蜂蜜樣品進行區分。采用SHS-GC-MS結合多變量分析為蜜源揮發性物質組成和蜂蜜溯源、品質提供了理論依據和技術支撐。