黃酮化合物對耐藥性鮑曼不動桿菌抑菌作用研究

沈煥圻，張昌發，林 航，陳 鑫，黃若詩，曾煦欣，郭嘉亮,*

1 佛山科學技術學院，佛山 528000；2 暨南大學藥學院，廣州 510632

耐藥菌感染是臨床抗感染治療中極為棘手的難題，也是造成重癥感染死亡的首要原因[1]。面對NDM-1等“超級細菌”的肆虐，傳統抗生素束手無策[2]。然而，近 30 年來世界范圍內針對耐藥菌的藥物研發卻一直未見較大進展[3,4]。鮑曼不動桿菌(AcinetobacterBaumanii，Ab)是一種非發酵乳糖的、需氧的、革蘭氏染色陰性的多形不動桿菌。作為醫院感染的重要病原菌之一，主要引起呼吸道感染，也可引發敗血癥、泌尿系感染、繼發性腦膜炎等。由于該菌生存能力強及獲得性耐藥能力強，甚至引發醫院內小規模暴發流行，對危重患者和CCU及ICU中的患者威脅很大。為控制鮑曼感染，臨床廣泛使用抗菌藥物，導致一些毒力因子的產生，進而提升了鮑曼的毒力及致病力，導致多重耐藥、廣泛耐藥、全耐藥的世界性流行。近年來，多重耐藥(multi drug resistant Ab,MDR-Ab)菌株為臨床治療帶來巨大的困難，目前MDR-Ab對臨床使用的抗菌藥物敏感性不斷下降，尤其對碳青霉烯類的耐藥率更高，造成耐碳青霉烯類Ab出現；即使多黏菌素等最有效的治療藥物，其耐藥性也逐漸提高。臨床已較長時間未出現新的有效藥物，常規治療藥又面臨耐藥的處境，造成如今幾乎無藥可用的局面，因此現在迫切需要尋找新的治療方法[5]。現有的研究較多集中在耐藥機制方面、遺傳基因、防護措施等方面[6]。開發新的抗菌藥物是克服該菌耐藥性的有效途徑，但新藥開發周期長、投入大。中藥及天然藥物是我國寶貴的資源，在治療感染性疾病方面有著悠久的歷史，其成分復雜、作用靶點多、抗菌譜廣，細菌較少對其產生耐藥，對于抗菌有其獨特的優勢，能延緩甚至逆轉細菌耐藥性產生，并且中藥低毒副作用、藥物來源廣泛、價格低廉，在抗菌治療中發揮具有極大的開發價值[6,7]。然而，中藥材成分復雜多樣，明晰其物質基礎，尋找具有有效抗菌作用的中藥單體尤為重要。目前許多中藥單體已被驗證了其良好的抑菌或多途徑逆轉細菌耐藥性效果[7]。從中草藥中探索研究新型抗菌化學實體有望成為發現對抗鮑曼不動桿菌的重要途徑。

此前，有報道指出中藥及天然來源的黃酮及其衍生物均具有良好的鮑曼不動桿菌抑制活性，甚至包括抑制細菌生物被膜的形成而達到對抗耐藥性的目的[8,9]，這引起了本課題組的高度關注。通過“抑菌+抗生物被膜”雙重作用，有望實現雙靶標對抗鮑曼不動桿菌的耐藥性問題。因此，本研究以三株耐藥性鮑曼不動桿菌菌株為研究對象，從40種中藥黃酮單體中篩選有效的抑菌成分(抑菌)，并進一步考察其生物被膜抑制活性(抗生物被膜)，為后續新型中藥抗生素的發現或者臨床上的聯合使用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑及菌株

野黃芩素、花旗松素、異鼠李素、漆黃素、漢黃芩苷、黃豆苷、葛根素、蕓香葉苷、木犀草苷、金絲桃苷、甘草素、鷹嘴豆牙素A、楊梅苷、橙皮素、黃芩素、木犀草素、山柰酚、芹菜素、柚皮素、黃芩苷、白楊素、染料木苷、金雀異黃酮、曲克蘆丁、野黃芩苷、綠原酸、異綠原酸A、野黑櫻苷、黃豆苷原、漢黃芩素、芥子酸、黃豆苷原、川陳皮素、淫羊藿苷、柚皮苷、梔子甙、黃芪甲苷、甘草苷、表兒茶素、兒茶素，合計40種黃酮單體(上海阿拉丁試劑有限公司)；氯已定(Sigma 公司)；頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(SCF，輝瑞公司)；將每種黃酮單體溶液以DMSO為溶劑配成濃度為10 mg/mL的溶液，混勻后置于25oC冰箱保存備用。

鮑曼不動桿菌菌株三株：Ab50986、Ab48929、Ab50822，來自廣州市華僑醫院2017年 1月～12月門診及住院病房檢驗標本培養分離，經常規藥敏試驗檢測均為多重耐藥菌株。NB固體培養基的配制：蛋白胨10 g/L、瓊脂粉15 g/L、牛肉膏3 g/L和NaCl 5 g/L，高壓滅菌鍋滅菌后，無菌條件下倒平板，待其凝固后，倒置，置于25oC冰箱冰箱保存備用。NB 液體培養基的配制：蛋白胨10 g/L、牛肉膏3 g/L和NaCl 5 g/L，高壓滅菌鍋滅菌后，同樣置于25oC冰箱保存備用。

1.2 主要儀器

恒溫培養箱(上海躍進醫療器械有限公司)，SW-CJ-1F 型單人雙面凈化工作臺(蘇州凈化設備廠)；KS4000i控制型控溫搖床(德國IKA公司)；WGZ-CJ-XJ 細菌比濁儀(上海昕瑞儀器儀表有限公司)；BL600 型電子分析天平(德國 Sartorius 公司)；Model 680 酶標儀(美國 Bio-rad 公司)；F-4500 熒光分光光度計(日本Hitachi公司)；微量加樣器、96孔細胞培養板、高壓滅菌鍋、干燥箱、冰箱等。

1.3 接種方法

分區劃線：取凍存菌株，用接種環先將標本涂布在NB平板作，每一區域的劃線應接觸上一區域的接種線 2～3 次，使菌量逐漸減少，使其形成單個菌落。劃線完畢，將平板加蓋，倒置(瓊脂平板的底部向上)于 37oC孵育12 h 后。分離傳代：用接種針垂直挑取細菌的單個菌落，點在另一個瓊脂平板上并作數次劃線，灼燒接種環，待冷切后繼續上一劃線操作。倒置(瓊脂平板的底部向上)于 37oC孵育培養12 h后，可供試驗用，現化現用。

1.4 菌液制備

從培養12 h的NB培養基上挑選菌落于NB培養基中，并校正濃度至 0.5 麥氏標準(1.5×108CFU/mL)，校正后的菌懸液用NB肉湯按1∶1 000稀釋，稀釋后立即使用。

1.5 最低抑菌濃度(MIC)測定

初篩：在無菌96 孔板(除第一列)中每孔加100 μL NB肉湯培養基，取適量的黃酮單體母液按1∶10的比例稀釋加入(同時加入頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉作對照之用)，每孔的藥物濃度為0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/mL；將稀釋好的菌液用排槍加入100 μL至孔中，取10 μL DMSO、90 μL NB培養基、100 μL菌液組成陰性對照組；另取200 μL NB培養基為空白對照組，封口膜封閉，于37 ℃ 孵箱中培養12 h，肉眼觀察判斷(平行測定3 次)。

精篩：參考文獻[8]，對初篩效果較好的黃酮單體繼續采用二倍稀釋法進行精篩(每孔的藥物濃度為0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625、0.007 812 5、3.91×10-4mg/mL)。如上文所述，以DMSO NB培養基、菌液組成陰性對照組；NB培養基為空白對照組(平行測定3 次)，此最低藥物濃度值為其 MIC 值。

1.6 最低殺菌濃度(MBC)測定

對精篩后獲得的中藥黃酮單體進行MBC 測定。將上述MIC的孔內液體混勻后，從每孔中分別取適量加到營養瓊脂平板上作次代培養，于37 ℃ 孵箱中培養12h，觀察結果，以肉眼觀察菌落不生長視為100%被殺滅，此最低藥物濃度值為其 MBC 值。

1.7 生物膜形成的定量分析

參考文獻[9]采用結晶紫染色法進行測定。在 96 孔板中每孔加入180 μL培養液(藥物終濃度為1/4 MIC)，接種20 μL 過夜培養菌液，37 ℃靜置孵育3天 和7天；無菌 PBS 緩沖液清洗板孔3次，甲醇固定20 min，自然風干；每孔加入100 μL 0.1% 結晶紫溶液，室溫下染色5 min；用流水把多余的染料沖洗干凈，除去殘余的水，并烘干；加入200 μL 33 % 冰乙酸溶液，在37 ℃培養箱中作用 30 min 以溶解結晶紫；600 nm條件下，用酶標儀測定培養孔中溶液的 OD 值；生物被膜抑制率=(A空白-A樣品)/A空白×100 %(平行測定3 次)。

1.8 聯合應用作用效果

將上述獲得的活性最佳的黃酮單體配制成不同濃度(1/16MIC、1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC、1 MIC)，混合不同濃度頭孢哌酮/舒巴坦(SFC)(1/16MIC、1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC、1 MIC)培養液，加入上述配制試驗菌液中，確保最終接種量；同時做空白和陽性對照，于37 ℃ 孵箱中培養12 h，觀察中黃酮與西藥頭孢哌酮/舒巴坦的聯合應用作用效果。通過部分抑菌濃度(FIC)指數判定兩藥聯合作用：FIC指數=MIC甲藥聯合/MIC甲藥單用+ MIC乙藥聯合/MIC乙藥單用。FIC指數≤0.5為協同作用，0.54.0為拮抗作用。

1.9 統計學處理方法

數據采用 SPSS 13.0 統計學軟件進行分析處理。

2 結果

2.1 最低抑菌濃度和最低殺菌濃度

如表1所示，不同黃酮單體對耐藥性鮑曼不動桿菌的抑菌作用差異較大。其中，野黃芩素、漆黃素、蕓香葉苷、金絲桃苷、甘草素、楊梅苷、橙皮素、曲克蘆丁、野黃芩苷、綠原酸、異綠原酸A、野黑櫻苷、芥子酸、川陳皮素、淫羊藿苷、柚皮苷、梔子甙、甘草苷、表兒茶素、兒茶素呈現出輕微的抑菌效果，其最低抑菌濃度為0.5 mg/mL；而黃芩素和漢黃芩苷效果最佳，如表2所示，經過精篩后確認其最低抑菌濃度分別為 0.062 5 和 0.125 mg/mL；其他篩選的黃酮單體則抑菌作用則不明顯，其MIC均大于0.5 mg/mL。

此外，如表3所示，經過測定后確認黃芩素和漢黃芩苷的對菌株Ab50986和Ab48929的最低殺菌濃度分別為 0.125、 0.25 mg/mL；對菌株Ab50822的最低殺菌濃度分別為 0.25、0.5 mg/mL，呈現出一定藥物作用的量效關系。

2.2 生物被膜定量分析結果

細菌生物膜主要成分由藻酸鹽組成，通過與結晶紫反應染色，檢測其在 600 nm 處的吸光度，從而間接反映生物被膜的量。參考文獻[9]，通過測量吸光度的變化來定量檢驗化合物對生物被膜的影響。如表4所示，以其中一種菌株(Ab50986)為例，結果表明黃芩素組對生物被膜的形成具有明顯抑制作用；漢黃芩苷組則沒有明顯的抑制作用。

2.3 聯合用藥結果

黃芩素對耐藥鮑曼不動桿菌(Ab50986)的藥物最低抑菌濃度 MIC 為 0.062 5 mg/mL；根據文獻報道[10]頭孢哌酮/舒巴坦對多重耐藥鮑曼不動桿菌的 MIC 為 0.256 mg/mL。如表5所示，以其中一種菌株(Ab50986)為例，黃芩素和頭孢哌酮/舒巴坦聯合作用于耐藥鮑曼不動桿菌，黃芩素濃度1/2 MIC時，用頭孢哌酮/舒巴坦濃度1/8 MIC可抑制耐藥鮑曼不動桿菌的生長(FIC=0.625)。黃芩素和頭孢哌酮/舒巴坦聯合用藥與單用黃芩素或頭孢哌酮/舒巴坦比較，增強了單獨用藥的抑菌效果，根據FIC指數判定，產生了部分協同作用。

表1 化合物對三株耐藥性鮑曼不動桿菌菌株的MIC 初篩結果(mg/mL，n=3)

表2 黃芩素與漢黃芩苷對三株耐藥性鮑曼不動桿菌菌株的MIC 精篩結果(mg/mL，n=3)

表3 黃芩素與漢黃芩苷對三株耐藥性鮑曼不動桿菌菌株的MBC 結果(mg/mL，n=3)

表4 黃芩素與漢黃芩苷對耐藥性鮑曼不動桿菌的生物被膜抑制率

表5 黃芩素聯合頭孢哌酮/舒巴坦對耐藥性鮑曼不動桿菌的抑制作用(n=3)

注：“-”表示細菌生長受到抑制 ，“+”表示細菌生長。

Note:“-”means bacterial growth is inhibited,“+”means bacterial growth.

3 討論

黃酮類化合物是中草藥的重要成分之一，有著很強的生物活性和藥理活性。近年來，黃酮及其衍生物以其廣譜的抑菌作用和生理活性，引起了科研工作者的高度關注。本文以中藥和天然藥物中常見的黃酮類化合物研究對象，實驗采取盲篩的方法對這40種黃酮單體進行篩選。從篩選的結果來看，大部分黃酮對耐藥性鮑曼不動桿菌均有不同程度的抑菌作用，其中以黃芩素與漢黃芩苷的抑菌效果較佳。黃芩素抑菌譜較廣，對常見致病菌如金黃色葡萄球菌球菌[11]、銅綠假單胞菌[8]都有較好的抑菌效果，但前期文獻檢索未見有關黃芩素對耐藥性鮑曼不動桿菌抑菌效果的研究報道。目前，該細菌與中藥黃芩相關的研究比較局限，如黃芩膠囊對多重耐藥鮑曼不動桿菌的體外抑菌效果觀察[12]以及黃芩等6種中藥對60株泛耐藥鮑曼不動桿菌的抑菌效果檢測[13]等，尚處于比較初步的階段，未具體深入到分子單體化合物的研究層面。為了明晰中藥作用機理，推動中藥現代化進程，急需更加深入的探索與研究。

此外，本文還首次探討了黃芩素對耐藥性鮑曼不動桿菌的生物被膜抑制效果。細菌生物被膜(biofilm)是細菌附著于平面后，自身分泌的多聚糖等基質包裹下形成的復合物，使細菌具有極高的耐藥性和免疫逃逸能力，也是發生細菌性感染難以治愈的重要原因。近年研究表明[9,14]，鮑曼不動桿菌可形成生物被膜，且與耐藥性有深入的聯系，使鮑曼不動桿菌可長期存在于醫院環境，包括不同材質的醫用材料表面，甚至醫護人員的指尖表面，最終導致耐藥的發生。本文的發現，為研究人員解決耐藥性鮑曼不動桿菌的治療問題提供了全新思路和方向。

鮑曼不動桿菌是近年來臨床分離的致病菌中的主要菌種，由于鮑曼不動桿菌在醫院內分布廣泛且其耐藥性因抗生素的過度使用不斷增強，導致由其引起的醫院感染發病率逐年上升。本研究基于“抑菌+抗生物被膜”的雙重策略，通過微量肉湯稀釋法和生物被膜定量分析，對多種中藥單體進行篩選，方法快速簡單方便，結果可靠；研究結果也初步提示了與頭孢哌酮/舒巴坦聯合用藥的可行性，同時也為抗耐藥菌中藥的物質基礎研究奠定了基礎。但由于本研究僅對三株多重耐藥鮑曼不動桿菌進行了體外抗菌效果，對更多的耐藥性鮑曼不動桿菌菌株是否有效尚待進一步驗證；同時藥物進入體內后能否達到積極的抗菌效果也需要進一步考察。