苦橙葉精油化學成分及抗炎作用研究

葉一丹，張 楠，李玉紅，姚 雷*

1上海交通大學農業與生物學院；2上海交通大學設計學院，上海 200240

苦橙(CitrusaurantiumL.subspeciesamaraL.)，蕓香科柑橘屬，近20年來被廣泛用于保健食品中，南美民間也常將其用于治療失眠、焦慮和癲癇。中醫臨床中主要將其制備成枳殼或枳實，治療消化不良、腹瀉和痢疾等[1]。其提取物具有抗氧化、抗肥胖及抗癌等作用[2-4]，相關研究表明苦橙果實中的黃酮類化合物也具有一定的抗炎能力[5]，苦橙皮中提取的川陳皮素抗炎作用體現在調節NF-κB信號通路中環氧合酶-2(COX-2)，誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)以及促炎因子等的表達[6]。

苦橙的果實、花、果皮被廣泛用于提取精油，有文獻報道來源于這三個部位的精油具有抗菌、抗焦慮、抗炎等功效[7-9]。但是目前對于苦橙葉的開發利用較少，鮮見對其精油的功效報道。本文對苦橙葉精油進行了化學成分分析，通過細胞及動物模型評價了其抗炎活性以期為苦橙葉的抗炎研究及開發利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 儀器

HF151二氧化碳培養箱，上海力申科學儀器有限公司；SHJ 系列潔凈工作臺，上海上凈凈化設備有限公司；L550 湘儀離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；Multiskan Go全波長酶標儀，上海賽默飛儀器有限公司；TE1502S 電子天平，北京賽多利斯科學儀器有限公司；CU-600 電熱恒溫水槽，上海一恒科技有限公司；7890B-5977A 氣相色譜-質譜聯用儀(GC-MS)，美國安捷倫公司。

1.2 試劑與材料

小鼠腹腔巨噬細胞(RAW 264.7)，購自中科院上海細胞庫；ICR小鼠，由上海交通大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SYXK(滬)2013-0050，4～6周鼠齡，實驗前適應性飼養1周，自由飲水進食；苦橙葉精油、薰衣草(Lavandulaangustifolia)精油、荷荷巴(Sismondiachinensis)油由上海交通大學芳香植物研究中心提供；復方醋酸地塞米松乳膏，來源于浙江仙琚制藥股份有限公司；RPMI 1640培養基，來源于美國HyClone公司；胎牛血清，來源于Gibco公司；脂多糖(LPS)、二甲基亞砜(DMSO)，來源于美國Sigma公司；CCK-8試劑盒，購自東仁化學科技有限公司；一氧化氮(NO)試劑盒，購自碧云天生物公司。

2 實驗方法

2.1 苦橙葉精油成分分析

采用GC-MS對苦橙葉精油進行成分分析。氣相條件：色譜柱：HP-5 ms(28.76 m×250 m×0.25 μm)，進樣溫度：270 ℃，柱溫50 ℃保持3 min，以4 ℃/min升至180 ℃，保持2 min，再以8 ℃/min升至240 ℃保持5 min，共運行60 min，載氣He，流速1.0 mL/min，進樣量1 μL，分流比30∶1。質譜條件：電離方式：EI+，70 eV；檢測器電壓：2 047 V；溶劑延遲：3 min；質量掃描范圍m/z：33～500全掃描。

2.2 RAW 264.7細胞培養

用RPMI-1640培養基(含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素)培養細胞，并置于37 ℃，5% CO2二氧化碳培養箱中，待細胞密度達到80%～90%，用不含EDTA胰酶進行細胞消化，以1∶3傳代，取對數生長期細胞進行實驗。

2.3 RAW 264.7細胞活性的測定

采用CCK-8法檢測苦橙葉精油對RAW 264.7細胞活性的影響。調節細胞密度至3×105個/mL，接種于96孔板，每孔100 μL，待細胞貼壁后，加入不同濃度的苦橙葉精油(0.1、1、10、50、100、200、500 μg/mL)為實驗孔，并設調零孔(僅培養基)和空白對照組(培養基+細胞)，每組6個復孔，培養24 h后吸上清，加入CCK-8試劑繼續培養1 h，于450 nm處測定各孔OD值。

細胞存活率(%)=(實驗孔﹣調零孔)/(對照孔﹣調零孔)× 100%

2.4 LPS誘導RAW 264.7細胞及致炎濃度確定

取對數生長期的RAW 264.7細胞，調節細胞密度為3×105個/mL，接種于96 孔板，每孔100 μL，待細胞貼壁后加入LPS刺激，刺激濃度為0.01、0.1、0.5、1、5 μg/mL，并設調零孔、空白對照組，每組設置4個復孔。24 h后用Griess試劑檢測細胞上清液，根據NaNO2的標準曲線計算NO含量。

2.5 苦橙葉精油作用下RAW 264.7細胞分泌NO含量的測定

取對數生長期的RAW 264.7細胞，調節細胞密度為3×105個/mL，接種于96 孔板，每孔100 μL，培養24 h后，加入不同濃度的苦橙葉精油使終濃度為1.56、3.13、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL，1 h后加入1 μg/mL的LPS進行刺激，繼續培養24 h后，檢測各孔吸光度值，根據標準曲線計算各組NO濃度。

2.6 苦橙葉精油抗炎作用動物模型檢測

2.6.1 實驗分組

本實驗中擬采用兩種陽性藥物。陽性對照一為復方醋酸地塞米松乳膏，此為常見的抗炎涂抹藥物。陽性對照二為薰衣草精油，有文獻報道薰衣草精油具有良好的抗炎活性[10]。本實驗所用精油均采用荷荷巴油作為基礎油進行配制，故設置對照荷荷巴油組，并設立空白組、模型組、苦橙葉精油低濃度(1%,v/v)組、苦橙葉精油中濃度(5%,v/v)組、苦橙葉精油高濃度(10%,v/v)組，共8組。

2.6.2 巴豆油致小鼠耳腫脹實驗

選取48只雄性ICR小鼠(體重20 ± 2 g)，按照上述分組方式隨機分為8組，地塞米松組按照0.05 mg/ear涂抹，根據文獻選擇陽性對照薰衣草精油組濃度為5%(v/v)，苦橙葉精油按1%、5%、10%的濃度分為低、中、高濃度組，各組分別于小鼠右耳正反面均勻涂抹對應藥物20 μL，連續給藥7天，每天一次，空白組不做任何處理。末次給藥后1 h，將致炎劑20 μL(巴豆油：無水乙醚：無水乙醇：蒸餾水=2∶73∶20∶5)均勻涂抹于各組小鼠右耳廓內外兩面致炎，左耳對照不做任何處理。2 h后處死小鼠，剪下小鼠雙耳，用直徑6 mm打孔器在左右耳對稱部分打下耳片，稱重計算其腫脹度和腫脹率，腫脹率(%)=(右耳重量-左耳重量)/左耳重量 × 100%，并將部分耳片制作組織切片，在光鏡下觀察各組耳片組織變化。

2.6.3 雞蛋清致小鼠足腫脹實驗

選取48只雄性ICR小鼠(體重20 ± 2 g)，按照上述分組方式隨機分為8組，地塞米松按濃度0.1 mg/只，薰衣草組濃度為5%(v/v)，苦橙葉精油低、中、高濃度組濃度為1%、5%、10%，各組分別于小鼠右足跖正反面均勻涂抹對應藥物30 μL，連續給藥7天，每天一次，空白組不做任何處理。末次給藥后1 h，將自制10%蛋清25 μL注射于小鼠足跖皮下致炎，分別在0.5、1.5、3、4 h后用游標卡尺測量小鼠左右足跖厚度，計算小鼠足跖腫脹率，腫脹率(%)=(右足跖厚度-左足跖厚度)/左足跖厚度×100%。

2.7 HE染色切片觀察

將小鼠耳片用10%(v/v)的福爾馬林溶液固定，脫水后石蠟包埋、切片，進行HE染色，光學顯微鏡下拍片，觀察小鼠耳腫脹程度和炎癥細胞浸潤情況。

2.8 統計學分析

實驗數據均采用SPSS 20.0統計軟件分析，用單因素方差齊性檢驗，Duncan檢驗多重比較顯著性，P<0.05時差異具有統計學意義。

3 結果與分析

3.1 苦橙葉精油化學成分分析

采用GC-MS方法共檢測到苦橙葉精油20種主要成分，如表1所示，分別為α-蒎烯、檜烯、β-蒎烯、月桂烯、對傘花烴、檸檬烯、(E)-β-羅勒烯、羅勒烯、萜品油烯、芳樟醇氧化物、芳樟醇、松油醇、橙花醇、乙酸芳樟酯、檸檬醛、乙酸松油酯、乙酸橙花酯、乙酸香葉酯、β-石竹烯和α-律草烯，其中酯類化合物占62.75%，醇類化合物占30.94%。含量最多的酯類和醇類化合物為乙酸芳樟酯和芳樟醇，兩者相對含量分別為54.72%和22.98%。

3.2 苦橙葉精油對RAW 264.7細胞活性的影響

通過CCK-8實驗來檢測苦橙葉精油對細胞活性的影響。結果表明，與空白對照組相比，濃度為0.1、10、50、100 μg/mL的苦橙葉精油對細胞活性無顯著影響，濃度為1 μg/mL的苦橙葉精油可以提高巨噬細胞活性，濃度為200、500 μg/mL的苦橙葉精油與空白組相比顯著降低了細胞活性(P<0.05)。以上結果表明苦橙葉精油在0～100 μg/mL的濃度范圍內不會顯著抑制細胞活性。

圖1 苦橙葉精油對RAW 264.7細胞活性的影響Fig.1 The effects of essential oil from leaves of Citrus aurantium L.subspecies amara L.on cell proliferation rate of RAW 264.7 macrophages cells注：圖中不同字母表示各濃度苦橙葉精油對RAW 264.7細胞活性具有顯著性差異(P<0.05)。Note:Different letters indicated significant difference between each group (P<0.05).

圖2 不同濃度LPS對RAW 264.7細胞釋放NO的影響Fig.2 Effect of LPS on RAW 264.7 macrophages cells release NO注：圖中不同字母表示各濃度LPS作用下對RAW 264.7細胞NO釋放量具有顯著性差異(P<0.05)。Note:Different letters indicated significant difference between each group (P<0.05).

3.3 LPS誘導RAW 264.7細胞致炎及致炎濃度的確定

與空白對照組相比，不同濃度LPS處理細胞后，其NO釋放量顯著增多，并且呈濃度依賴性(圖2)。1 μg/mL的LPS刺激細胞產生14.1 mmol/L的NO，為空白組4.9倍(P<0.05)。基于對細胞狀態的考慮，后續實驗選用濃度為1 μg/mL的LPS濃度進行細胞刺激。

3.4 苦橙葉精油對RAW 264.7細胞分泌NO的影響

采用Griess法檢測不同濃度苦橙葉精油對LPS誘導RAW 264.7細胞NO釋放量的影響。結果表明25、50、100 μg/mL苦橙葉精油均能顯著降低RAW 264.7細胞NO釋放量(P<0.05)(圖3)，其中25 μg/mL精油濃度處理下NO釋放量最少，表明該濃度苦橙葉精油具有較好的抗炎效果。

圖3 苦橙葉精油對RAW 264.7細胞釋放NO的影響Fig.3 Effect of essential oil from leaves of Citrus aurantium L. subspecies amara L.on RAW 264.7 macrophages cells release NO注：圖中不同字母表示各濃度苦橙葉精油對LPS刺激RAW 264.7細胞NO釋放量具有顯著性差異(P <0.05)。Note:Different letters indicated significant difference between each group (P<0.05).

3.5 苦橙葉精油對巴豆油致小鼠耳腫脹模型影響及組織形態學分析

巴豆油誘導小鼠耳腫脹模型中，在巴豆油誘導后20 min內小鼠耳朵出現紅腫現象，并在2～3 h內達到最大腫脹度。實驗結果表明，對照處理與模型組相比不會影響小鼠的耳腫脹程度。與空白組相比，各組耳腫脹明顯(P<0.05)，與模型組相比，地塞米松和薰衣草精油這兩種陽性藥物及中(5%)、高濃度(10%)苦橙葉精油對于巴豆油所致小鼠耳腫脹均有顯著抑制作用(P<0.05)，其中中濃度苦橙葉精油腫脹抑制率最高。

從圖5 HE染色結果可以看出，與空白對照組小鼠耳組織相比，涂抹了巴豆油的模型組及對照組小鼠耳組織有明顯的水腫和淋巴細胞浸潤現象，造模成功。并且地塞米松組、薰衣草油組及苦橙葉中、高濃度組能明顯地減輕巴豆油誘導的小鼠耳水腫和淋巴細胞浸潤現象。

3.6 苦橙葉精油對雞蛋清致小鼠足腫脹模型的影響

如圖6所示，模型組小鼠在造模后足跖腫脹明顯，于造模后1.5 h左右腫脹度達到高峰，并于4 h后緩慢恢復，各濃度苦橙葉精油均對小鼠足腫脹有一定抑制作用，并于腫脹前期呈濃度依賴性。總體上，高濃度苦橙葉精油前2 h抗炎效果最佳，且效果較陽性對照薰衣草組好，但其作用尚不及地塞米松組的作用強，且起效不及地塞米松快。造模3 h后，中濃度苦橙葉精油藥效較低、高濃度苦橙葉精油組組好。

4 討論

許多研究表明芳香植物精油的藥用價值很高，具有抑菌、抗炎鎮痛、抗病毒等生物活性[11-13]。但我國對精油植物資源的開發利用多限于香精香料及化妝品領域，僅少數用于醫藥等其他行業。

圖4 苦橙葉精油對巴豆油致小鼠耳腫脹的影響Fig.4 Effect of essential oil from leaves of Citrus aurantium L. subspecies amara L. on edema of mouse ear induced by croton oil注：圖中不同字母表示各濃度苦橙葉精油對小鼠耳腫脹率具有顯著性差異(P<0.05)。Note:Different letters indicated significant difference between each group (P<0.05).

圖5 巴豆油誘導的小鼠耳片(HE,×200)Fig.5 Histological sections of ear from croton oil treated mouse(HE,×200)注：A) 空白對照組;B) 模型組;C)對照組;D) 地塞米松組;E) 薰衣草油組;F) 苦橙葉油低濃度組;G) 苦橙葉油中濃度組;H) 苦橙葉油高濃度組。Note:A) Blank group;B) Model group;C) Control group;D) Dexamethasone group;E) Lavender oil group;F) Low concentration group;G) Middle concentration group;H) High concentration group.

炎癥是多種疾病的基本病理過程，但過度的炎癥會對機體產生不同程度的危害[14]，NO是動物體內極強的自由基，起到神經遞質作用，并調節免疫系統[15]，細胞實驗中常用此指標評價藥物抗炎效果。本文通過對LPS致炎RAW 264.7細胞，研究苦橙葉精油作用下細胞活性和NO釋放量，發現苦橙葉精油具有一定的體外抗炎活性，其體外抗炎作用可能與抑制NO等炎癥介質的產生有關。

巴豆油致小鼠耳腫脹和雞蛋清致小鼠足腫脹實驗是常用的急性炎癥模型，前者可改變血管通透性、刺激巨噬細胞、分泌促炎介質[16]。后者可使致炎局部的前列腺素合成增加，并引起炎癥介質的釋放等形成腫脹[17]。地塞米松常用來篩選抗炎藥物[18]，其抗炎作用機制為減少COX-2的表達，抑制前列腺素產生和巨噬細胞的活動等[19]。薰衣草精油可通過抑制促炎因子及自由基等的釋放發揮抗炎作用[20]。在實驗中，通過涂抹給藥方式，發現中、高濃度苦橙葉精油對巴豆油所致的小鼠耳腫脹均有顯著抑制作用并可改善組織水腫，但高濃度精油效果不及中濃度，可能由于中濃度比高濃度苦橙葉精油更溫和地發揮抗炎作用。低、中、高濃度組對小鼠足腫脹均有不同程度抑制作用，在致炎后1～3 h之間作用明顯，說明苦橙葉精油具有一定的抗急性炎癥作用，并且實驗結果與兩種陽性藥物有相同的作用趨勢，且GC-MS結果表明，苦橙葉精油中含有的乙酸芳樟酯和芳樟醇占總相對含量的77.69%，薰衣草精油也含有大量乙酸芳樟酯和芳樟醇，由此推測其主要的抗炎的作用機制可能與薰衣草精油類似。

圖6 苦橙葉精油對雞蛋清致小鼠足腫脹的影響Fig.6 Effect of essential oil from leaves of Citrus aurantium L.subspecies amara L. on edema of mouse paw induced by egg-white注：圖中在同一時間點中不同字母表示各濃度苦橙葉精油對小鼠足腫脹率具有顯著性差異(P<0.05)。Note:Different letters indicated significant difference between each group (P<0.05).

苦橙葉精油開發成本低，本研究證明苦橙葉精油具有一定體外和體內抗炎作用，為之后進一步深入探究苦橙葉精油抗炎作用機制提供了科學理論依據，為合理且有效地開發苦橙精油提供了研究基礎。