制首烏醇提物及其主要成分大黃素對(duì)斑馬魚(yú)非酒精性脂肪肝的治療作用

余琳媛，全云云，龔莉虹，王 成，李蕓霞

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，成都611137

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除酒精和其他明確的損肝因素所致的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過(guò)度沉積為主要特征的臨床病理綜合征。近年來(lái)，隨著生活水平的提高，我國(guó)肥胖人群和代謝綜合征(Metabolism syndrome，MS)人數(shù)逐漸增多，NAFLD發(fā)病率也明顯升高。在接下來(lái)的數(shù)十年中，NAFLD可能超過(guò)乙型肝炎成為威脅我國(guó)公眾健康的新疾病[1]。目前，西醫(yī)缺乏治療NAFLD病的有效手段和藥物[2]。不少藥物研發(fā)者將目光轉(zhuǎn)向了祖國(guó)傳統(tǒng)的降脂中藥。

何首烏為蓼科植物何首烏(PolygonummultiflorumThunb)的干燥塊根，臨床應(yīng)用有生首烏和制首烏之別。何首烏經(jīng)傳統(tǒng)方法炮制后，可降低毒性，具有化濁降脂的功效，是一種傳統(tǒng)的降脂中藥。其提取物中主要含二苯乙烯苷、蒽醌類(lèi)物質(zhì)，其中二苯乙烯苷類(lèi)化合物可調(diào)節(jié)肝臟紊亂的脂代謝，蒽醌類(lèi)化合物能結(jié)合膽固醇，抑制膽固醇肝內(nèi)沉積，從而有效治療脂肪肝[3]。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)展的前期，通過(guò)設(shè)置2 mg/mL的蛋黃粉加制首烏水提液組，并根據(jù)最低致死濃度8 mg/mL，以0.5 mg/mL為梯度濃度，進(jìn)行給藥，發(fā)現(xiàn)制首烏水提液對(duì)斑馬魚(yú)的肝臟脂質(zhì)沉積無(wú)減輕作用。同理，根據(jù)50%制首烏醇提液對(duì)斑馬魚(yú)的最低致死濃度4 mg/mL，以0.5 mg/mL的梯度濃度進(jìn)行給藥，發(fā)現(xiàn)1、1.5、2 mg/mL的濃度對(duì)肝臟沉積有治療作用。因此，采用HPLC法對(duì)制首烏水提液和醇提液進(jìn)行成分含量分析，二者在成分上有6個(gè)共同峰，分別為兒茶素、沒(méi)食子酸酯、二苯乙烯苷、大黃素苷、大黃素、大黃素甲醚，50%醇提液在6個(gè)成分的含量上均高于水提液，將這6種成分單獨(dú)對(duì)NAFLD斑馬魚(yú)給藥，發(fā)現(xiàn)除大黃素以外，其余5種成分均無(wú)治療作用。并且，大黃素在醇提液和水提液中是含量差別最大的成分，接近13倍，根據(jù)大黃素對(duì)斑馬魚(yú)的最低致死濃度2 μg/mL，以0.5 μg/mL的梯度濃度進(jìn)行給藥，發(fā)現(xiàn)1、0.5、0.25 μg/mL的濃度對(duì)肝臟沉積有治療作用。因此實(shí)驗(yàn)選取了2、1.5、1 mg/mL的制首烏醇提液和1、0.5、0.25 μg/mL的大黃素作為治療斑馬魚(yú)NAFLD的高、中、低濃度。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制首烏醇提物與其主要成分大黃素對(duì)非酒精性脂肪肝動(dòng)物模型的影響，研究制首烏對(duì)非酒精性脂肪肝斑馬魚(yú)肝脂質(zhì)沉積的干預(yù)作用及存在治療作用的有效物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試藥

禮順堂售制首烏，由成都中醫(yī)藥大學(xué)生藥鑒定室裴瑾教授鑒定為蓼科植物何首烏(PolygonummultiflorumThunb)的干燥塊根；大黃素購(gòu)于成都克洛瑪生物科技有限公司，批號(hào)為A0044。

1.2 動(dòng)物

野生型AB品系(wide-type AB strian)斑馬魚(yú)，由成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)繁殖。實(shí)驗(yàn)用斑馬魚(yú)幼魚(yú)為雌雄母魚(yú)交配后所產(chǎn)的受精卵養(yǎng)至96 hpf(hours post fertilization)，挑選孵化出的健康個(gè)體進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 試劑

蛋黃粉(源葉生物公司，批號(hào)為S30910)、斑馬魚(yú)幼魚(yú)飼料AP100(Zeigler)、飽和油紅O溶液(Solarbio)、二甲基亞砜(DMSO，分析純，Sigma公司)。乙醇、丙二醇、蘇木精、伊紅染液(華俊醫(yī)療器械公司)、TG測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)為A110-1)、TC測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)為A111-1)。

1.4 儀器

Sartorius 11D型電子分析托盤(pán)天平(德國(guó)Sartorius公司)、M165-FC體式顯微成像系統(tǒng)(德國(guó)Lei-ca公司)、Leica EG1150H包埋機(jī)(德國(guó)Lei-ca公司)、Multiskan Mk3型酶標(biāo)儀(美國(guó)賽默飛世爾(上海)儀器有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 何首烏醇提物的提取

精密稱(chēng)取制首烏粗粉0.25 g，置圓底燒瓶中，加20倍量50%乙醇，浸泡30 min后，加熱回流60 min，過(guò)濾后離心，取濾液45 ℃旋蒸至無(wú)乙醇味，再取續(xù)濾液給藥。

2.2 分組及給藥方案

取若干條5 dpf(days post fertilization)的斑馬魚(yú)幼魚(yú)，隨機(jī)分組為正常對(duì)照組、模型組、制首烏50%乙醇提取物高、中、低劑量組2、1.5、1 mg/mL和大黃素高、中、低劑量組1、0.5、0.25 μg/mL，于六孔板中飼養(yǎng)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每孔47條幼魚(yú)，正常對(duì)照組于每日上午按說(shuō)明書(shū)用量給于普通飼料AP100(AP100飼料浮于水面即可)，其余各組每日上午給于2 mg/mL蛋黃粉，給藥組采用預(yù)防給藥，在造模同時(shí)，分別給予高、中、低濃度的制首烏醇提物2、1.5、1 mg/mL和大黃素1、0.5、0.25 μg/mL，正常對(duì)照組和模型組加入6 mL魚(yú)水，制首烏醇提物組加入魚(yú)水和制首烏醇提液，大黃素組加入魚(yú)水和大黃素稀釋液，二者加起來(lái)達(dá)到6 mL液體，連續(xù)72 h。

2.3 存活率觀測(cè)

分別于造模給藥后72 h，觀察并記錄各組斑馬魚(yú)的存活條數(shù)，計(jì)算百分率。

2.4 體重、體長(zhǎng)和體質(zhì)量指數(shù)(BMI)測(cè)量

用三卡因麻醉液將幼魚(yú)麻醉，用吸水紙將幼魚(yú)表面水吸干，在天平中稱(chēng)量體質(zhì)量并記錄。用游標(biāo)卡尺測(cè)量幼魚(yú)頭部最前端到魚(yú)尾最末端距離，這段長(zhǎng)度代表幼魚(yú)體長(zhǎng)，BMI為體質(zhì)量(mg)除以體長(zhǎng)(mm)的平方所得的數(shù)值。

2.5 整體油紅O染色檢測(cè)肝臟脂質(zhì)沉積

隨機(jī)選取各組斑馬魚(yú)幼魚(yú)多條放在培養(yǎng)皿中，4%多聚甲醛固定12 h，PBS洗兩次，依次按25%、50%、75%、100%的丙二醇濃度進(jìn)行梯度脫水，用新鮮配置的0.5%油紅避光孵育過(guò)夜。再依次按100%、75%、50%、25%的丙二醇濃度復(fù)水，PBS洗凈背景，于25%丙二醇4 ℃保存。M165-FC體式顯微鏡拍照統(tǒng)計(jì)，并根據(jù)肝臟染色程度評(píng)價(jià)各組的肝臟脂肪沉積率。

2.6 肝組織病理檢測(cè)

用4%多聚甲醛固定96 h，脫水，65 ℃石蠟包埋制備石蠟標(biāo)本，石蠟切片機(jī)切取石蠟切片，蘇木素-伊紅染色(HE染色)，顯微鏡下觀察并拍照。

2.7 斑馬魚(yú)體脂測(cè)定

將斑馬魚(yú)幼魚(yú)按體質(zhì)量(g)：體積(mL)為1∶9加入無(wú)水乙醇勻漿，離心，吸出上清液，按照甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)試劑盒說(shuō)明書(shū)，測(cè)量幼魚(yú)體內(nèi)甘油三酯和總膽固醇濃度。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果與分析

3.1 存活率觀測(cè)

對(duì)不同組別斑馬魚(yú)生長(zhǎng)和死亡情況分析，可以看出正常對(duì)照組生長(zhǎng)正常，體表色素正常，無(wú)死亡。模型組體表泛白，存活率偏低。給藥組死亡率降低，活動(dòng)度增強(qiáng)。各組生存率如圖1所示；與空白組相比，蛋黃粉組存活率顯著降低(P<0.05)，與蛋黃粉組相比，低、中、高RPMP組與EMO組存活率均顯著增高(P<0.05)。

圖1 不同濃度的何首烏醇提物和大黃素對(duì)NAFLD斑馬魚(yú)存活率的影響Fig.1 Effect of different concentrations of ethanol extract of Polygonum multiflorum and emodin on the survival rate of NAFLD zebrafish

3.2 體重、體長(zhǎng)、BMI測(cè)定

與空白對(duì)照組相比，模型組幼魚(yú)體重、體長(zhǎng)和BMI顯著增加(P<0.05)；給藥后，RPMP組、emodin組與模型組相比，中劑量組的體重、體長(zhǎng)和BMI均極顯著降低(P<0.01)(見(jiàn)表1)。

3.3 整體油紅O染色

按照斑馬魚(yú)肝臟染色深淺分成“正常”(如圖2A)、“輕微”(如圖2B)、“嚴(yán)重”(如圖2C)三種情況，圖2中的黃色箭頭指向肝臟。“正常”、“輕微”、“嚴(yán)重”的區(qū)分在于，“正常”肝臟由于無(wú)脂質(zhì)沉積，肝臟不可被油紅染色；“輕微”肝臟有脂質(zhì)沉積，脂質(zhì)沉積較少或只有部分肝臟有脂質(zhì)沉積，因此肝臟被油紅染色淺或只有部分肝臟被染色；“嚴(yán)重”肝臟表示肝臟脂質(zhì)沉積嚴(yán)重，整個(gè)肝臟被油紅染成紅色，并且染色很深[4]。肝臟染色后對(duì)各組進(jìn)行分類(lèi)統(tǒng)計(jì)。從圖2中可以看出，肝臟脂質(zhì)沉積嚴(yán)重的斑馬魚(yú)，尾部和血管脂質(zhì)染色的堆積也嚴(yán)重。運(yùn)用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)后，分析得出制首烏醇提液和大黃素能明顯減少斑馬魚(yú)血管中脂質(zhì)的沉積率，緩解斑馬魚(yú)幼魚(yú)對(duì)蛋黃粉吸收形成的肝臟脂肪沉積，見(jiàn)圖3。(肝臟脂肪沉積率統(tǒng)計(jì)包含“輕微”、“嚴(yán)重”)

3.4 肝臟病理組織觀察

對(duì)照組斑馬魚(yú)肝組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)正常，模型組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常，導(dǎo)致肝臟出現(xiàn)空泡，肝細(xì)胞變形，

表1 各組喂養(yǎng)72 h后幼魚(yú)體質(zhì)量、體長(zhǎng)、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)變化

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note:Compared with the blank group,#P<0.05,##P<0.01;compared with the model group,*P<0.05,**P<0.01.

圖2 斑馬魚(yú)幼魚(yú)肝臟脂質(zhì)的沉積的情況Fig.2 The deposition of liver lipids in zebrafish juveniles 注：A：肝臟無(wú)脂質(zhì)沉積屬于“正常”，B：肝臟有部分脂質(zhì)沉積，屬于“輕微”，C：肝臟脂質(zhì)沉積嚴(yán)重，屬于“嚴(yán)重”；黃色箭頭指向肝臟；具體各組肝臟脂質(zhì)沉積情況見(jiàn)圖3。Note:A:lipid-free deposition in the liver is “normal”,B:shows partial lipid deposition in the liver,C:severe liver lipid deposition.the yellow arrow points to the liver;the lipid deposition in the liver of each group is shown in Fig.3.

肝內(nèi)可見(jiàn)脂滴(圖4)。造模同時(shí)給予何首烏提取液和大黃素干預(yù)后，與模型組相比，細(xì)胞排列逐漸正常，肝臟組織的空泡減少，幼魚(yú)肝細(xì)胞脂肪沉積情況有一定程度的減輕。

3.5 體脂測(cè)定結(jié)果

與空白組相比，模型組幼魚(yú)TG極顯著增加(P<0.01)，TC顯著增加(P<0.05)；給藥后，何首烏醇提液組和大黃素組與模型組相比，TG顯著降低(P<0.05)(見(jiàn)表2)。

4 結(jié)論

NAFLD最常見(jiàn)的原發(fā)病為高血脂、肥胖和2型DM[5]。且有資料表明，NAFLD患者的死亡率明顯高于同齡正常人群[6]，因此，本實(shí)驗(yàn)將死亡率作為評(píng)價(jià)NAFLD的指標(biāo)之一。NAFLD的發(fā)展是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，早期的病變主要是脂質(zhì)在肝細(xì)胞內(nèi)的過(guò)度聚集。當(dāng)TG和TC中任何一個(gè)指標(biāo)含量過(guò)高時(shí)，都可能引發(fā)NAFLD。其中，TG與NAFLD的發(fā)生直接相關(guān)，脂肪肝主要是TG大量堆積于肝臟所致的一種病理改變，因此測(cè)定肝組織中TG的含量尤為重要[7]。通過(guò)整體油紅染色可以觀察到圖4中空白組有一定比例的“部分”脂肪肝發(fā)生，應(yīng)該是在魚(yú)類(lèi)的養(yǎng)殖中，膳食的營(yíng)養(yǎng)平衡很難達(dá)到，脂肪肝與營(yíng)養(yǎng)的平衡息息相關(guān)，在人工飼養(yǎng)的環(huán)境中，斑馬魚(yú)獲得的膳食營(yíng)養(yǎng)、生存環(huán)境都很難與野生斑馬魚(yú)相形媲美，加上幼魚(yú)和雌魚(yú)的肝臟脂肪沉積對(duì)膳食能量的含量更為敏感。而且有報(bào)道稱(chēng)，魚(yú)類(lèi)肝臟增加甘油三酯合成的初始階段是為了避免高游離脂肪酸在循環(huán)中誘導(dǎo)的脂毒性，這屬于一種自我保護(hù)機(jī)制[8]，因此，斑馬魚(yú)幼魚(yú)中出現(xiàn)的“輕微”脂肪肝，不應(yīng)完全視作病理狀態(tài)。

圖3 油紅染色顯示各組肝臟脂質(zhì)沉積百分率Fig.3 Oil red staining shows the percentage of liver lipid deposition in each group注：肝臟脂質(zhì)沉積程度分為“正常”“輕微”“嚴(yán)重”；“正常”不計(jì)入統(tǒng)計(jì)學(xué)與空白組比較。#P <0.05，##P <0.01；與模型組比較，*P <0.05，**P <0.01。Note:The degree of liver lipid deposition is divided into “none”,“some” and “steatosis”;among them,“none” is not counted in statistics.Compared with the blank group,#P <0.05,##P <0.01;compared with the model group,*P <0.05,**P <0.01.

圖4 各組喂養(yǎng)72 h后各組幼魚(yú)肝臟組織學(xué)的改變(×400)Fig.4 Changes in liver histology of juvenile fish in each group after 72 hours of feeding (×400)

表2 各組喂養(yǎng)72 h后幼魚(yú)體脂的變化

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01;與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note:Compared with the blank group,#P<0.05,##P<0.01;compared with the model group,*P<0.05,**P<0.01.

制首烏具有化濁降脂的功效，能夠有效改善高血脂，緩解患者的膽固醇、甘油三酯等，并能夠很好地促進(jìn)患者的脂肪代謝，提高代謝的頻率[9]。CHAN等[10]對(duì)SAMP8小鼠分別給予何首烏水提液、50%何首烏醇提液、95%何首烏醇提液，結(jié)果顯示50%何首烏醇提液組的小鼠TG與TC較其他兩組顯著降低，證實(shí)50%何首烏醇提液降脂效果更顯著。因此，實(shí)驗(yàn)選取了50%的首烏醇提液。有相關(guān)研究表示，制首烏提取液可以有效減輕兔的肝臟細(xì)胞脂肪病變，這一作用可能與甘油三酯和膽固醇在體內(nèi)的代謝有關(guān)[11]。目前，有關(guān)何首烏提取物治療NAFLD的報(bào)道較少，但是關(guān)于何首烏治療NAFLD的主要成分研究很多。何首烏提取物及其主要成分二苯乙烯苷可顯著降低大鼠體內(nèi)TC含量，并有效治療非酒精性脂肪肝[12]，蒽醌類(lèi)有效成分能夠通過(guò)降低小鼠血脂，發(fā)揮抗氧化、抗自由基及保肝護(hù)肝的效用[13]，其中游離型蒽醌大黃素可降低小鼠肝內(nèi)TG水平,減少肝臟脂肪沉積[14]。實(shí)驗(yàn)前期通過(guò)給予造模成功的NAFLD斑馬魚(yú)何首烏水提液，發(fā)現(xiàn)水提液無(wú)治療作用，因此分別對(duì)50%何首烏醇提液和水提液色譜圖跑出的6個(gè)共同峰進(jìn)行含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)醇提液中大黃素的含量是水提液的12.99倍，而其他5種成分的含量差別不足2倍，推測(cè)大黃素可能為治療NAFLD的主要活性成分，有研究表明，何首烏中大黃素降甘油三酯作用最強(qiáng)，二苯乙烯苷降總膽固醇效果最強(qiáng)[15]，結(jié)合醇提液中大黃素的含量遠(yuǎn)超水提液，且醇提液和大黃素在TG含量的降低中呈現(xiàn)出顯著的效果，對(duì)大黃素單體進(jìn)一步的藥效驗(yàn)證后得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，似乎大黃素比制首烏醇提液的治療效果更好，從肝臟切片的結(jié)果來(lái)看，大黃素組肝臟細(xì)胞間脂肪空隙比醇提物更少，且中劑量的大黃素還表現(xiàn)出了降低TC的作用，根據(jù)HPLC法，分析出制首烏醇提液中大黃素的含量為0.16 μg/mg，即低、中、高劑量制首烏醇提取物中含大黃素的濃度分別為0.16、0.24、0.32 μg/mL，前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)0.25 μg/mL以下濃度的大黃素是沒(méi)有治療作用的，說(shuō)明制首烏治療NAFLD是多種成分協(xié)調(diào)起作用，但大黃素在其治療NAFLD中扮演了重要角色。有很多報(bào)道和臨床經(jīng)驗(yàn)表明何首烏具有一定的肝毒性，且認(rèn)為何首烏主要的肝毒性成分是蒽醌類(lèi)[16]，尤其是蒽醌中的大黃素與大黃酸，但是醇提物達(dá)到致死濃度4 mg/mL時(shí)，大黃素的濃度才0.64 μg/mL，是很安全的劑量，因此大黃素在何首烏中肝毒性最大的說(shuō)法有待考究。綜上，制首烏和大黃素對(duì)NAFLD均有很好的治療作用，且制首烏的療效是以大黃素為主要成分，其他成分協(xié)同作用導(dǎo)致，具可做進(jìn)一步具體研究。