懷地黃葉片中總環烯醚萜苷及總苯乙醇苷含量快速分析模型的建立

耿曉桐，王豐青，謝彩俠*，陶曉賽，李雅靜，雷敬衛

1河南中醫藥大學，鄭州 450046；2河南農業大學，鄭州 450000

地黃為玄參科植物地黃 (RehmanniaglutinosaLibosch.) 的新鮮或干燥塊根，具有清熱生津之功效[1]，主產于河南、山西、山東、河北等地，以“古懷慶府”(今河南的溫縣、沁陽、武陟、孟縣等地)一帶地黃栽培歷史最長，俗稱“懷地黃”，為我國“四大懷藥”之一，也是我國具有特殊地理標志的常用大宗藥材之一。

地黃中主要含有環烯醚萜苷類、苯乙醇苷類、紫羅蘭酮類、糖類等化合物，地黃葉片作為地黃植株重要的部位，在地黃整個生長發育期內的生物量較高，而且含有多種化學成分[2]。研究表明，地黃葉片中部分苯乙醇苷和環烯醚萜苷類成分含量高于地黃塊根[3，4]，作為商品藥材，地黃葉被收載于 1988年版《北京市中藥材標準》[5]。近幾年，隨著地黃的臨床應用和研究的不斷深入，地黃在方劑中的使用頻率明顯增多。另外，由于市場上具有清涼滋補的地黃保健食品的開發，使地黃的市場需求量不斷增加，但由于地黃的連作障礙和土地資源有限等原因導致地黃資源相對緊缺，因此地黃葉的開發利用開始逐漸被研究者所關注。

中藥藥效的發揮往往是多個有效部位群整體協同作用的結果，總環烯醚萜苷和總苯乙醇苷作為地黃中重要的兩類有效成分[6]，其含量的高低在一定程度上可以反映地黃葉片質量的優劣，因此建立一種可以快速檢測總環烯醚萜苷及總苯乙醇苷含量的方法對于地黃葉片的質量評價及資源利用具有重要的意義。目前常規測定中藥中總環烯醚萜苷及總苯乙醇苷含量所采用的方法有紫外可見分光光度法、HPLC法[7,8]、UPLC-MS法[9]、聚酰胺吸附法[10]、二階導數光譜法[11]等，但地黃樣品用于測定總苯乙醇苷及總環烯醚萜苷的含量測定基本均用紫外分光光度法[12,13]，綜合考慮到紫外分光光度法處理較為復雜、誤差來源較多、試劑用量較大，污染較為嚴重，近紅外光譜法作為一種無損、快速、綠色的分析方法已經廣泛的應用于中藥的質量分析中[14,15]，而地黃葉片中總環烯醚萜苷及總苯乙醇苷含量快速測定方法的研究未見報道。基于此，本研究以不同種質的懷地黃為研究對象，采集其生育期內的地黃葉片，利用紫外可見分光光度法結合化學計量學軟件建立懷地黃葉片中總環烯醚萜苷和總苯乙醇苷含量的測定方法，以實現地黃葉片質量的快速評價和合理利用。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

萬分之一電子天平(METTLER TOLEDO梅特勒-托利多儀器上海有限公司)、HH-S2雙孔智能水浴鍋(鞏義市予華儀器有限責任公司)、Nicolet 6700 型傅立葉變換近紅外光譜儀(美國Thermo Nicolet 公司) 、紫外-可見分光光度計(EVOLUTIION 260 BIO，Thermo)、石英比色皿(宜興市銀星分析器件廠)。

1.2 試劑

毛蕊花糖苷(四川省維克奇生物科技有限公司，批號：MUST-17020715)、梓醇(成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-17102510)、甲醇(分析純，天津市致遠化學試劑有限公司)、無水乙醇(天津市致遠化學試劑有限公司，分析純)、2，4-二硝基苯肼(天津市大茂化學試劑廠)、鹽酸(煙臺市雙雙化工有限公司)、氫氧化鈉(天津市恒興化學試劑制造有限公司)、蒸餾水(鄭州山溪泉蒸餾水有限公司)。

1.3 實驗樣品

實驗以金九、白變、山東、BJ-1、QH-1、85-5等六個常見地黃種質的葉片為研究對象，每次每個種質隨機選取5株作為一個樣品，每次每個種質共收集10株，即兩份樣品。從6月～12月整個生育期內收集了六個種質地黃葉片共128份。將地黃葉片洗凈，在真空干燥箱中55 ℃烘干，經高速萬能粉碎機粉碎后過50目篩，保存于干燥器中備用。

2 結果與分析

2.1 懷地黃葉片近紅外光譜的采集

取適量懷地黃葉片粉末平鋪于近紅外光譜儀的樣品杯中，采用積分球漫反射法，在光譜范圍12 000～4 000 cm-1、分辨率8 cm-1、掃描次數64的條件下獲取128份地黃葉片樣品近紅外光譜圖。每份樣品重復掃描3次，取其平均光譜作為每份樣品的最終光譜，葉片的近紅外原始光譜疊加圖見圖1。

圖1 128份地黃葉片的近紅外原始光譜疊加圖Fig.1 128 near infrared primordial spectral superposition of Rehmannia glutinosa leaves

2.2 地黃葉片中總環烯醚萜苷含量的測定[4]

2.2.1 供試品溶液的制備

精確稱量地黃葉片粉末1 g，加70%乙醇10 mL超聲45 min，補足重量，過濾后定容至50 mL容量瓶中，搖勻。精密量取2.5 mL于50 mL容量瓶中，加70%乙醇定容，搖勻，即得地黃葉片的供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液的制備

精確稱量梓醇對照品 5.21 mg 置于25 mL量瓶中，加70%乙醇溶液定容即得。

2.2.3 樣品的含量測定

采用外標法進行含量測定，精密量取地黃葉片的供試品溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，加入1 mol/L鹽酸溶液2 mL，搖勻，90 ℃水浴15 min，室溫靜置放冷，加二硝基苯肼乙醇溶液 0.5 mL，搖勻，90 ℃水浴25 min，室溫靜置 15 min 放冷，再加入 1mol/L NaOH 70%乙醇溶液 3 mL，搖勻，室溫靜置1 h。以 70% 乙醇作為空白對照，測定462 nm下的吸光度。每份樣品重復三次，結果取三次平均值為一組數據，共測得兩份數據，以保證數據的準確性。地黃葉片中總環烯醚萜苷的含量測定結果見表1。

2.2.4 方法學考察

2.2.4.1 標準曲線的制備

分別精密量取2.2.2項下梓醇對照液1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL 于10 mL 容量瓶中，加70 %乙醇定容，即對照品濃度分別為0.031 3、0.041 7、0.052 1、0.062 5、0.083 4 mg/mL。制備方法同供試品，在462 nm波長下測定吸光度，重復測定三次，取其平均值。以吸光度(A)為縱坐標，對照品濃度(C)為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程y=10.609x-0.091 8,R2=0.995 5，結果表明梓醇濃度在0.031 3～0.083 4 mg/mL-1范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

圖2 地黃葉片總環烯醚萜苷類含量標準曲線Fig.2 Standard curve of total iridoid glycosides in Rehmannia glutinosa leaves

2.2.4.2 精密度試驗

取同一供試品溶液按2.2.3項下方法連續測定5次，記錄吸光度，RSD為1.14%。說明儀器的精密度良好。

2.2.4.3 穩定性試驗

取同一供試品溶液按2.2.3項下方法于0、30、60、90、120 min連續測定5次，記錄吸光度。RSD為0.71%。說明供試品溶液在2 h內穩定。

2.2.4.4 重復性試驗

稱量同一樣品5份，按照2.2.1項下方法制得供試品，按照2.2.3項下方法測定吸光度，RSD為2.08%。說明該方法重復性好。

2.3 地黃葉片中總苯乙醇苷含量的測定[16]

2.3.1 供試品溶液的制備

稱取地黃葉片粉末約1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇50 mL，稱定重量。超聲處理30 min后放至室溫，補足重量，搖勻，過濾。精密量取續濾液1 mL，至50 mL容量瓶中，60%甲醇定容即得地黃葉片的供試品溶液。

2.3.2 對照品溶液的制備

取毛蕊花糖苷對照品1.21 mg于10 mL容量瓶中，甲醇定容即得。

2.3.3 樣品的含量測定

采用外標法進行含量測定，取地黃葉片的供試品溶液于比色皿中，用紫外分光光度計在334 nm處測量吸光度，每份樣品重復三次，取三次結果的平均值為一組數據，每份樣品共測得兩組數據，以確保數據的準確度。地黃葉片中總苯乙醇苷的含量測定結果見表2。

2.3.4 方法學考察

2.3.4.1 標準曲線的制備

精密吸取2.3.2項下毛蕊花糖苷對照品儲備液0.5、0.6、0.7、1.0、1.2、1.8 mL分別置于5 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，即對照品濃度分別為0.012 1、0.014 5、0.016 9、0.024 2、0.029 0、0.043 5 mg/mL。同時以相應的溶劑作空白，于 334 nm 波長處測定各對照品溶液的吸光度，重復測定三次，取其平均值。以吸光度(A)為縱坐標，對照品濃度(C)為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程y=25.9 4x+0.078 1，R2=0.992 5。結果表明，毛蕊花糖苷質量濃度與吸光度在0.012 1～0.043 5 mg/mL范圍內呈良好的線性關系。

2.3.4.2 精密度試驗

取同一供試品溶液按2.3.3項下方法連續測定5次，記錄吸光度，RSD為2.04%。說明儀器的精密度良好。

2.3.4.3 穩定性試驗

取同一供試品溶液按2.3.3項下方法于0、30、60、90、120 min連續測定5次，記錄吸光度。RSD為1.25%。說明供試品溶液在2 h內穩定。

2.3.4.4 重復性試驗

稱量同一樣品5份，按照2.3.1項下方法制得供試品，按照2.3.3項下方法測定吸光度，RSD為1.65%。說明該方法重復性好。

表1 地黃葉片中總環烯醚萜苷的含量測定結果(%)

續表1(Continued Tab.1)

樣品編號Sample serial number總環烯醚萜苷Total iridoid glycoside樣品編號Sample serial number總環烯醚萜苷Total iridoid glycoside樣品編號Sample serial number總環烯醚萜苷 Total iridoid glycoside253.739683.6431114.125263.751693.9431124.578273.294703.9251133.862284.485712.8601143.789291.183722.9101154.746301.516734.0561164.671314.486744.1651174.325323.942753.2701184.042333.002763.2921193.862342.986774.2941203.755354.382784.6401214.228364.238793.5181223.847374.891803.2321234.054384.558812.5281244.017393.283822.6971254.257402.824832.5581264.467412.445842.7781273.880422.740855.1021284.172433.765864.480

表2 地黃葉片中總苯乙醇苷含量測定結果(%)

續表2(Continued Tab.2)

樣品編號Sample serial number總苯乙醇苷Total iridoid glycoside樣品編號Sample serial number總苯乙醇苷Total iridoid glycoside樣品編號Sample serial number總苯乙醇苷Total iridoid glycoside164.097592.4941024.162173.122602.5911037.409183.045612.7171047.197195.275622.8421052.681205.291635.1761062.668213.942645.1471076.089223.917655.0331086.095231.940665.1871093.562241.917672.8321103.527256.001682.7801116.881266.197693.6331126.955273.063703.5401132.406283.197711.4201142.409294.875721.4651153.288304.175734.1091163.385314.039743.8011176.880323.943753.5201186.954331.782763.5411194.822341.849773.3991204.787353.464783.7951214.778363.362793.8901224.884376.235803.9991234.926385.994811.7831244.958394.432821.8241252.535404.413830.985 1262.593412.443840.979 1271.598422.456854.9221281.974435.091865.127

注：1-24為85-5地黃生育期內的樣品，25-48為BJ-1地黃生育期內的樣品，49-72為白變地黃在生育期的樣品，73-96為金九地黃在生育期內的樣品，97-112為山東地黃生育期內的樣品，113-128為QH-1地黃在生育期內的樣品。

Note:1-24 is 85-5 Rehmannia glutinosa growing period sample.25-48 is BJ-1 Rehmannia glutinosa growing period sample.49-72 is Baibian Rehmannia glutinosa growing period sample.73-96 is the sample of Jinjiu Rehmannia glutinosa in the growing period.97-112 is the sample of Shandong Rehmannia glutinosa in the growing period， and 113-128 is the sample of QH-1 Rehmannia glutinosa in the growing period.

2.4 地黃葉片中總環烯醚萜苷及總苯乙醇苷近紅外定量分析模型的建立

2.4.1 校正集和驗證集樣品的選擇

根據“2.2”項下地黃葉片中總環烯醚萜苷含量及“2.3”項下地黃葉片中總苯乙醇苷苷含量的分布，按照校正集和驗證集樣品數為4∶1的比例、驗證集樣品的含量范圍在校正集的含量范圍之內的原則，總環烯醚萜苷模型隨機選取102個地黃葉片樣品作為校正集、24個地黃葉片樣品作為驗證集，總苯乙醇苷模型隨機選取103個地黃葉片樣品作為校正集、25個葉片樣品作為驗證集，分別建立地黃葉片中總環烯醚萜苷及總苯乙醇苷的定量分析校正模型，校正集和驗證集的樣品信息見表3、表4。

表3 地黃葉片校正集和驗證集樣品總環烯醚萜苷分布范圍

表4 地黃葉片校正集和驗證集樣品總苯乙醇苷分布范圍

2.4.2 光譜預處理方法的選擇

不同種質生育期內的地黃葉片由于發育程度、物理性質及測定條件等的差異，會引起光譜基線的漂移以及斜率的變化，進而影響模型的預測性能。當模型的內部交叉驗證決定系數(R2)接近于1，校正均方根偏差(RMSEC)和預測均方決定差(RMSEP)差別較小時模型的預測能力較強，因此我們以上述參數為指標，考察了不同光譜預處理方法對模型性能的影響，以選擇最優的預處理方法，結果見表5、表6。

表5不同光譜預處理方法對地黃葉片總環烯醚萜苷定量校正模型性能的影響

Table 5 Effect of different spectral pretreatment methods on quantitative calibration model of total iridoid glycosides in leaves of Rehmannia glutinosa

光譜預處理方法R2RMSEPRMSEC多元散射校正MSC0.951 80.303 00.339 0標準歸一化SNV0.957 30.265 00.319 0一階導數First derivative0.972 10.095 40.259 0二階導數Second derivative0.964 30.156 00.292 0SNV+First derivative0.966 40.130 00.284 0MSC+First derivative0.961 70.200 00.303 0MSC+Second derivative0.968 50.167 00.275 0SNV+Second derivative0.961 40.183 00.304 0MSC+SD+卷積平滑SG0.968 80.184 00.273 0MSC+SD+直接差分法ND0.923 90.443 00.422 0

表6不同光譜預處理方法對地黃葉片總苯乙醇苷定量校正模型性能的影響

Table 6 Effect of different spectral pretreatment methods on quantitative calibration model of total phenylethanol glycosides in leaves ofRehmanniaglutinosa

光譜預處理方法R2RMSEPRMSECMSC0.997 00.1600.116 0SNV0.997 70.1700.101 0MSC+FD0.998 00.2110.095 3MSC+SD0.998 20.1420.089 9SNV+FD0.997 50.2680.106 0MSC+FD+SG0.998 10.2580.091 4SNV+FD+ND0.996 30.2430.129 0

結果表明地黃葉片中總環烯醚萜苷及總苯乙醇苷原始光譜分別選用constant+FD、MSC+SD的光譜預處理方法可以獲得預測性能較好的模型。

2.4.3 建模區間的選擇

近紅外光譜主要反映基團伸縮振動產生的倍頻峰、組頻峰的信息，由于倍頻峰及組頻峰峰強較弱不易區分，各峰重疊嚴重，因此冗余信息以及噪音干擾較大。為了獲取與待測組分含量相關的最大信息量，以建立最優的預測模型，我們對不同波段范圍所建模型的性能進行考察，以篩選最優建模區間，結果見表7、表8。

表7 光譜范圍對地黃葉片總環烯醚萜苷定量校正模型性能的影響

表8 光譜范圍對地黃葉片總苯乙醇苷定量校正模型性能的影響

通過TQ 8.0軟件分析各波段范圍所對應的R2、RMSECV值可知，地黃葉片總環烯醚萜苷及總苯乙醇苷定量分析模型的最佳建模區間均為11 998.9 3～3 999.63 cm-1。

2.4.4 主因子數的選擇

在相同的校正集樣品下，主因子數的選擇對模型的穩定性和NIR預測結果有較大影響，主成分數過少或過多均影響模型的預測準確性。本研究以RMSECV為評價模型性能參數，選擇RMSECV最小時的因子數即為最佳主因子數。結果見圖4。由圖知，地黃葉片總環烯醚萜苷及總苯乙醇苷定量校正模型的最佳主因子數分別為7和9。

圖4 主因子數對RMSECV的影響Fig.4 Effects of principal factor numbers on RMSECV注：A.總環烯醚萜苷；B.總苯乙醇苷。Note:A.Total iridoid glycosides；B.Total phenylethanol glycoside.

2.4.5 地黃葉片中總環烯醚萜苷及總苯乙醇苷定量模型的建立

分別以103個地黃葉片總環烯醚萜苷樣品和102個地黃葉片總苯乙醇苷樣品為校正集，利用TQ 8.0分析軟件結合PLS 法，分別選擇最佳的光譜預處理方法、建模波段和主因子數建立地黃葉片中總環烯醚萜苷及總苯乙醇苷的定量分析模型。地黃葉片中總環烯醚萜苷及總苯乙醇苷NIR預測值與參考值的相關圖及偏差圖見圖5、圖6。

圖5 地黃葉片中總環烯醚萜苷含量NIR預測值與參考值之間的相關圖與偏差圖Fig.5 Correlation and deviation between NIR predicted value and reference values of total iridoid glycosides in leaves of Rehmannia glutinosa注：A 相關圖；B 偏差圖。Note:A.correlation;B.deviation.

圖6 地黃葉片中總苯乙醇苷含量NIR預測值與參考值之間的相關圖與偏差圖Fig.6 Correlation and deviation between NIR predicted value and reference values of total phenethyl glucoside in leaves of Rehmannia glutinosa 注：A 相關圖；B 偏差圖。Note:A.correlation;B.deviation.

2.4.6 地黃葉片中總環烯醚萜苷和總苯乙醇苷定量模型的驗證

分別將24份總環烯醚萜苷驗證集樣品和25份總苯乙醇苷驗證集樣品的近紅外光譜圖輸入到相應的近紅外定量模型中，將總環烯醚萜苷及總苯乙醇苷含量的NIR預測值與實測值進行比較，結果見表9、表10。由表知，NIR模型預測總環烯醚萜苷及總苯乙醇苷的含量結果與常規的UV法測定的數據比較接近，絕對及相對偏差較小；且總環烯醚萜苷配對樣本t檢驗結果顯示t=0.240，P=0.813>0.05，總苯乙醇苷配對樣本t檢驗結果顯示t=1.296，P=0.207>0.05。以上結果表明預測值與實測值的差異無統計學意義，說明兩個模型的預測性能較好，可以用于地黃葉片中總環烯醚萜苷及總苯乙醇苷的含量測定。

3 討論

近紅外光譜技術作為一種間接的分析方法，它主要運用化學計量學軟件從樣品復雜的背景與譜峰重疊的近紅外光譜圖中提取和樣品性質相關的信息，建立光譜特征與樣品性質等之間關系的數學模型，可用于物質的定量及定性分析。一般情況下，在待測組分含量高、樣品數量多、樣品代表廣泛、基礎數據測定準確、儀器性能穩定的條件下所建立的模型性能相對較好。本研究結果表明，總環烯醚萜苷及總苯乙醇苷作為地黃重要的有效成分，在地黃葉片中含量較高，比較適合于利用近紅外光譜法進行快速測定。另外，不同種質生育期內地黃葉片中苯乙醇苷類和環烯醚萜苷類成分差異較大，為了保證樣品的代表性，我們以道地產區的金九、白變、山東、BJ-1、QH-1、85-5等六個常見地黃種質在不同生育期內的地黃葉片為研究對象，經過基礎數據測定、建模條件的優選，建立了可以相對準確的預測懷地黃中總環烯醚萜苷及總苯乙醇苷含量的近紅外地定量分析模型，為懷地黃葉片的快速質量評價提供一種可參考的方法。

表9 24份總環烯醚萜苷驗證集樣品的NIR預測結果(%)

表10 25份總苯乙醇苷驗證集樣品的NIR預測結果(%)

續表10(Continued Tab.10)

樣品編號Sample serial number測定值Measured value預測值Predictive value絕對偏差Absolute deviation相對偏差Relative deviationP523.3643.300-0.064-0.020533.4033.399-0.004-0.001655.0335.1120.0790.016693.6333.6940.0610.017711.4201.361-0.059-0.042773.9993.907-0.092-0.023840.9791.0140.0350.036914.8624.802-0.060-0.012943.6053.6250.0200.0061003.1653.137-0.028-0.0091014.2044.116-0.088-0.0201024.1624.116-0.046-0.0111052.6812.653-0.028-0.0101142.4092.4130.0040.0021214.7784.8080.0300.0061252.5352.5570.0220.009

地黃種植區域廣泛，因受自然環境、生產種植、采收加工、雜交和變異及人文環境等多因素影響，最終形成了一系列地黃栽培種及其變種，而且不同種質和產地的地黃葉片色澤、厚度、化學質量特征及近紅外光譜特征都存在一定的差異。本研究主要利用懷地黃產區不同種質及生育期的地黃葉片的相關信息，經過對光譜背景的處理，初步建立了懷地黃葉片中總環烯醚萜苷及總苯乙醇苷的定量分析模型，但模型中并沒有包括不同產地的地黃葉片信息，因此模型的使用范圍還受到一定的限制，后期還有待于繼續豐富地黃葉片樣本，進一步完善和優化模型，為快速檢測地黃葉片的質量以合理開發利用地黃葉片資源提供一種簡便可行的方法。