一株鐵皮石斛內生真菌的色素穩定性研究

雒曉芳，許淑娟，潘和平*

1西北民族大學實驗教學部；2西北民族大學生命科學與工程學院，蘭州 730030

鐵皮石斛是蘭科石斛屬的多年生草本植物。不僅是傳統的珍貴中藥材，也是高檔的觀賞花卉，擁有很高的觀賞價值。鐵皮石斛含有多種內生真菌，但只有一些內生真菌能有效地促進石斛的生長發育，組織、宿主、環境等因素的影響在組織和宿主中表現出一定的差異[1]。

微生物與植物體相互作用關系由來已久，大多數植物體的根、莖、葉中都分布著數量眾多和種類繁多的微生物[2]。內生菌作為植物微生態系統中的天然組成部分，對植物具有多方面的積極作用。在生物防治上，植物內生菌系統地分布于植物體內，有充分的碳源和氮源的供應，比暴露于外界的惡劣環境中更有利于發揮作用[3]。所以具有重要經濟價值和藥用價值的鐵皮石斛內生真菌成為篩選新活性物質的重要資源[4-8]。

隨著人們對天然色素的關注度不斷提高，現在人們發現某些細菌、真菌等微生物產生的色素也可以作為天然染料用于紡織品的染色中，成為天然染料的新的一大來源[9-11]。天然色素的色澤不穩定，在使用過程中易受多種因素(如光、溫度、氧化、pH值、介電極性等)的影響，并影響褪色和變色，影響其著色效果[12-18]。因此研究色素的穩定性具有非常重要的意義。

本實驗從鐵皮石斛中分離出1株產色素的內生真菌，其色素為水溶性胞外色素。以這株產橙紅色色素鐵皮石斛內生菌為材料，對產生橙紅色色素的穩定性進行初步探究，為該色素進一步開發利用奠定基礎。

1 材料

1.1 實驗材料

在云南省普洱市寧洱縣五里坡選取生長優良，表面無病蟲害的仿野生生長三年以上整個植株。觀察形態特征，綠桿“硬腳”，植株莖較圓，與節部有黑褐色環狀間隙，萼片和花瓣黃綠色，經由西北民族大學生命科學與工程學院郭鵬輝老師和實驗教學部微生物學分室的雒曉芳老師鑒定為鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)。

1.2 培養基

麥芽汁瓊脂培養基：氯霉素0.1 g ，pH為6.0±0.2，麥芽膏粉30 g ，瓊脂15 g蒸餾水1 L，121 ℃高壓滅菌30 min。

馬鈴薯瓊脂糖培養基(PDA)， pH為6.0：把土豆沖洗干凈，去皮。將200 g切成小塊，加入純水1 L，煮沸半小時，補純水至1 L。在濾液中加入10 g瓊脂，煮沸后加入20 g糖，溶解(用糖培養霉菌，用葡萄糖作酵母培養物)補水，121分鐘滅菌30 min。

高鹽察氏培養基：氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g ，氯化鈉60 g ，蔗糖30 g ，瓊脂20 g ，蒸餾水1 L， 121 ℃高壓滅菌30 min。

營養瓊脂培養基：牛肉膏 1 g ，酵母膏 2 g，蛋白胨 5 g ，NaCL 5 g ，瓊脂 15 g，加水定容至1 L。調pH為7.4，加熱溶解，121 ℃高壓滅菌30 min。

LB固體培養基：胰化蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 5 g，瓊脂粉15 g，搖動容器直至溶質溶解。用5mol/L NaOH調pH至7.4，去離子水定容至1 L。 加熱溶解，121 ℃高壓滅菌30 min.。

營養肉湯培養基：牛肉膏1 g ，酵母膏2 g，蛋白胨5 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，加水定容至1 L。調PH為7.4，加熱溶解，121 ℃高壓滅菌30 min。

LB液體培養基：胰化蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 5 g，搖動容器直至溶質溶解。用5mol/L NaOH調pH至7.4，去離子水定容至1 L。 加熱溶解，121 ℃高壓滅菌30 min。

1.3 試劑

鹽酸、蔗糖、氫氧化鈉、無水乙醇、異丙醇、10%SDS、雙氧水、1X TAE(pH 8.0)、1%氯化汞、亞硫酸鈉、硫酸雙氫鏈霉素、青霉素G鉀 、10 mg/mL Rnase(Sigma)、PCR試劑盒、乳酸石炭酸棉藍染色液、5%石炭酸水溶液。

2 方法

2.1 菌種篩選

選取新鮮健康的鐵皮石斛植株的根段、莖段和葉片用流水沖洗干凈，按照插片法將切片等距離均勻分別放置于含鏈霉素(50～100 mg/L)和青霉素(100～300 mg/L)的5種固體培養基上(3～4片/皿)，分別為麥芽汁瓊脂培養基、高鹽察氏培養基、營養瓊脂培養基、LB固體培養基、PDA培養基。于26 ℃黑暗條件下培養5～10天待切片周圍長成肉眼可見的菌落時，以平板劃線法分離真菌培養。將初篩后獲得的一株優勢菌種連續富集培養三次。富集培養均無出現雜菌，繼續以平板劃線法分離純化菌株，重復三次。通過肉眼對培養特征的觀察選擇生長優良的菌株。將所得的單菌株接于斜面上26 ℃培養3～5天后，4 ℃保存備用。

2.2 真菌鑒定

真菌菌體用液氮研磨后提取總DNA，然后用ITS擴增引物ITS1和ITS4進行PCR擴增并測序。將測序結果與NCBI數據庫(NR) 進行比對，并將序列進行BLAST比對，構建進化樹。

2.3 色素測定

2.3.1 色素的提取

用接種環取活化后的菌絲體于麥芽汁瓊脂固體培養基中，在 26 ℃恒溫黑暗培養3～5天。至產生的色素達到飽和時除去菌絲體，保留僅存色素的培養基，然后按體積比1∶2(w/v)加入蒸餾水在60 ℃水浴條件下進行浸提1 h，經過8層紗布過濾掉培養基等大塊的固體雜質，用濾紙過濾后37 ℃烘箱干燥得到橙紅色素粗提物。用蒸餾水配制濃度為 1% 的色素溶液作為母液。

2.3.2 色素吸收光譜曲線的測定

取1%的色素溶液，用G10S UV-VIS雙光束紫外可見分光光度計在 300～700 nm 范圍內掃描，以 10 nm為掃描間隔，記錄數據，利用 Excel軟件分析找到最大吸收波長。測出的最強吸收峰波長值將作為后續實驗中的參考值。

2.3.3 色素色價測定

色價測定參照GB 1886.34-2015 “食品安全國家標準食品添加劑辣椒紅”的方法做了適當調整：準確稱取0.25 g 色素粗品，精確至 0.000 2 g，用蒸餾水溶解于 25 mL 的容量瓶中，配制成濃度為 1% 的色素溶液，適當稀釋使吸光值控制在 0.3 ～ 0.7 范圍內，用蒸餾水為對照，測定其在最大吸收波長處的吸光值。色價 E 和色價保存率計算公式如下：

2.4 色素的穩定性研究

2.4.1 溫度對色素穩定性的影響

取適當稀釋后的色素溶液，分別置于 4、20、40、60、80、100 ℃ 恒溫水浴鍋中避光保溫 1 h，迅速冷卻至常溫觀察顏色變化，以蒸餾水為對照分別測定其在最大吸收波長處的吸光值，計算色素色價保存率。

2.4.2 pH對色素的影響

取適當稀釋后的色素溶液，分別用 1mol/mL NaOH 和 1mol/mL HCl調節 pH 為 2、4、6、8、10、12，室溫避光靜置 1 h，觀察顏色變化，分別測定其在最大吸收波長處的吸光值計，計算色素色價保存率。

2.4.3 光照對色素穩定性的影響

取 5 mL 適當稀釋的色素溶液于玻璃皿中，用保鮮膜封口，分別置于自然光照、紫外光照和避光條件下持續處理 24 h，分別測定其在3、6、9、12 h時的最大吸收波長處的吸光值，計算色素色價保存率。

2.4.4 氧化劑與還原劑對色素穩定性的影響

取9 mL 適當稀釋的色素溶液，分別加入 1 mL濃度為 0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%的氧化劑 H2O2和濃度為 0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%的還原劑Na2SO3。室溫避光靜置 1 h，分別測定其在最大吸收波長處的吸光值，計算色素色價保存率。

2.4.5 金屬離子對色素穩定性的影響

取9 mL 適當稀釋的色素溶液，分別加入 1 mL濃度為1%的5種金屬離子溶液FeCl3、ZnSO4、CuSO4、CaCl2和MnCl2，室溫避光靜置1 h，分別測定其在最大吸收波長處的吸光值，計算色素色價保存率。

2.4.6 常見添加劑對色素穩定性的影響

取9 mL 適當稀釋的色素溶液，分別加入 1 mL濃度為5%、10%、15%、20%、25%的NaCl、蔗糖、葡萄糖溶液。室溫避光靜置 1 h，分別測定其在最大吸收波長處的吸光值，計算色素色價保存率。

3 結果與分析

3.1 菌株的形態特征

用5種不同的固體及對應的液體培養基經過初篩、富集培養以及分離純化，得到一株鐵皮石斛優勢內生真菌，將其命名為X1。菌株 X1菌落在麥芽汁瓊脂培養基上培養26 ℃培養3天，即形成較典型的菌落，菌落呈白色、蛛網狀，無隔。分生孢子梗發生于基質，壁平滑，帚狀枝為雙輪生或三輪生，?；枯?～3個，瓶梗每輪4～8個，分生孢子為橢圓形，壁平滑，分生孢子鏈圓柱狀。

3.2 分子生物學鑒定

3.2.1 16S rDNA擴增

圖1 X1的 PCR電泳圖Fig.1 Electrophoretic diagram of X1

Marker條帶組成：100 bp，250 bp，500 bp，750 bp，1 000 bp，2 000 bp，3 000 bp，5 000 bp。750 bp條帶濃度為60 ng/3 μL，顯示為加亮帶，其余條帶濃度均為30 ng/3 μL。電泳方向從下向上。

3.2.2 進化樹構建

將X1菌株鐵皮石斛內生真菌優勢菌的16S rDNA的核酸序列經序列用比對用軟件MEGA5.1進行多重比對并繪制了系統進化樹。結果如圖2所示。結果表明：X1菌株與鏈孢霉菌屬中的Neurosporaafricana的16S rDNA序列有99%的同源性，可見X1與鏈孢霉菌具有較近的遺傳距離。結合形態學及分子生物學染色實驗結果綜合分析，將X1與鏈孢霉菌屬中的Neurosporaafricana具有較近的遺傳距離。

圖2 X1系統進化樹Fig.2 Ehylogenetic tree of X1

3.3 色素穩定性

3.3.1 不同波長條件下色素紫外吸收光曲線

圖3 不同波長下橙紅色色素的OD曲線Fig.3 The OD curve of orange red pigment at different wavelengths

由圖3可知，300～210 nm范圍內為下降趨勢，320～400 nm范圍內為持續上升，至400～700 nm為緩慢下降的趨勢，故可得最大吸收峰為波長λ為400 nm。故本實驗選擇400 nm 作為最大吸收波長。

3.3.2 不同溫度條件對色素色價的影響

圖4 不同溫度對色素色價的影響Fig.4 The effect of different temperatures on the color color of the pigment

由圖4可知，20～60 ℃時色素的保存率處于上升階段，60～100 ℃是色素的保存率則處于連續下降階段，溫度為60 ℃時其色價保存率最好為82%即對色素的影響較小，對色素有護色反應。所以選擇60 ℃作為該色素的提取溫度。

3.3.3 不同pH值對色素色價的影響

圖5 不同pH值對色素色價的影響Fig.5 The effect of different pH on the color value of pigment

用 1mol/m L Na OH 和 1mol/m L HCl調節經稀釋的色素溶液的pH 分別為 2、4、6、8、10、12，室溫放置1 h，取不同pH的1 mL色素溶液測定吸光度值。由圖5可知，pH為2～8時的色價保存率持續上升，pH在8～12的時候連續下降，所以色價保存率最好為pH=8時，色價保存率為56%。說明pH的變化對色素的色價影響較大。色素宜儲存于中性或弱堿性環境，強堿性環境比酸性環境對色素的色價穩定性影響更大。

3.3.4 不同光照條件對色素穩定性的影響

圖6 不同光照條件對色素色價的影響Fig.6 The effect of different light on the color price of pigment

將10 mL色素溶液放置于自然光、紫外、避光三個條件下室溫持續處理12 h。每3 h取1 mL的色素溶液測定吸光度值。由圖6可知，紫外條件下，0～6 h范圍內色素溶液的色價持續上升，6～12 h色素溶液色價持續下降。自然光條件下，0～3 h色價先下降，3～6 h色價上升，6 h后色素溶液色價持續下降。避光條件下，對該色素色價的影響可忽略不計。在自然光和紫外條件下， 6 h時均會發生增色反應，間接證明紫外對該色素具有增色反應。避光條件下，對該色素的色價影響可忽略不計，可將色素溶液避光保存。

3.3.5 不同濃度H202和Na2SO3溶液對橙紅色素穩定性的影響

圖7 H202和Na2SO3對色素色價的影響Fig.7 The effect of H2O2 and Na2SO3 on color value of pigment at different concentrations

由圖7可知，經氧化劑H202和還原劑Na2SO3處理后，色素對H202和Na2SO3溶液較敏感。隨著濃度的上升，整體呈下降趨勢，對色素一直保持減色反應。

3.3.6 不同金屬離子對色素穩定性的影響

圖8 不同金屬離子溶液對色素色價的影響Fig.8 The effect of different metal ion in the solution of the dye color value

由圖8可知，濃度為1%的Fe3+、Zn2+、Cu2+、Ca2+和Mn2+5種金屬離子溶液對色素溶液均有不同程度影響。其中，Fe3+、Ca2+對色素溶液具增色反應，Zn2+、Cu2+、Mn2+對色素溶液有保色效果。

3.3.7 不同常見添加劑對色素穩定性的影響

由圖9可知，經不同濃度NaCl溶液處理后，5%～10%范圍內色素色價呈上升趨勢，于10%時色素色價達到峰值，10%之后色素溶液色價持續下降。經不同濃度葡萄糖溶液處理后，5%～15%范圍內色素色價呈上升趨勢，15%時色素色價達到峰值，15%～25%色素溶液色價持續下降。不同濃度的蔗糖對該色素的色價幾乎沒有影響。

圖9 不同常見添加劑對色素色價的影響Fig.9 The effect of different common additives on color Price of pigments

4 討論

內生真菌(endophytic fungi) 指長期生活在植物的根、莖、葉等器官的組織內部，但一般不引發植物體病害的真菌。鏈格孢是經濟上重要的真菌屬之一。大多數種類兼性寄生于植物上， 引起多種經濟植物病害，造成田間和產后損失。有幾個鏈格孢小孢子種可侵染人和動物， 引起皮癬、甲癬、顎骨髓炎等疾病。鏈格孢產生的某些真菌毒素是重要的致癌因素。另一方面， 鏈格孢也是有應用潛力的生物資源， 如一些鏈格孢次生代謝物具有殺蟲、殺菌和殺原生生物活性。長柄鏈格孢中某些菌株分生孢子壁中含有激發子組份， 可被用來制成防治煙草赤星病的生防制劑等[19]。X1菌株與脈孢菌中的Neurosporaafricana親源關系最近，為99%。脈孢菌屬在遺傳研究及生化途徑研究上廣泛應用，且其菌體內含豐富蛋白質、維生素B12等，可用于工業發酵和制作飼料。

發現并選擇能夠大量生產色素的真菌，作為一種新型的天然染料應用與紡織品的染色中，利用真菌培養的優勢對于色素進行工業化生產，將有望解決天然植物染料不能滿足人們的需求的難題，使得天然染料更好的為人們使用[20]。因此，本實驗選擇X1內生真菌所產生的橙紅色色素對其穩定性進行初期研究。經研究分析，發現該水溶性橙紅色色素色價保存率易受到批次影響，不同批次的1%色素溶液色價均有差異。并且也發現該色素溶液不能低溫保存，低溫保存對其色價有很大影響。每次提取配制的色素溶液，只可以于常溫避光放置一周。后續實驗將會通過多個單因子實驗和正交實驗對橙紅色色素的提取工藝進行優化，為色素進行工業化生產提供理論依據。