土壤真菌Curvularia affinis HS-FG-196抗腫瘤化學(xué)成分的再研究

陳麗君，張寶新，張杭鋒，張 輝*，王繼棟

1 臺州市立醫(yī)院西藥房； 2 浙江省抗真菌藥物重點實驗室 浙江海正藥業(yè)股份有限公司，臺州 318000

棘殼孢素(pyrenocines)是1979年Sato,H.等人從洋蔥粉色根腐病菌(Pyrenochaetaterrestris)分離得到的植物毒素，他們從中得到pyrenocines A和B[1]，同年申請了pyrenocines A和B的專利，保護了其制備方法及作為植物生長抑制劑的用途[2]。但是在后續(xù)的研究中，他們發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)被鑒定錯誤，Sato,H.等人1981年通過單晶衍射確定了其結(jié)構(gòu)[3]。在對P.terrestris次級代謝產(chǎn)物的進一步研究中，Sato,H.等人首次從該菌的次級代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的另一類新的植物毒素—棘殼孢酸(pyrenochaetic acids)，他們從中分離得到pyrenochaetic acids A，B 和C，并報道了其之間的相互轉(zhuǎn)化及對植物生長的抑制作用[4]。這類化合物后續(xù)報道較少，但是pyrenocines類化合物被大量發(fā)現(xiàn)，如pyrenocines C-R等[5-9]，同時這類化合物的生物活性也得到了更大的發(fā)掘。Pyrenocines除具有抑制植物生長的植物毒素作用外還具有抗菌、抗真菌、抗錐體蟲、抗瘧乃至細(xì)胞毒素活性[6]，其豐富的生物活性決定其具有很好的研究價值及開發(fā)潛力。

在前期研究中[10]，我們從土壤真菌CurvulariaaffinisHS-FG-196中分離得到兩個新化合物pyrenocine J、pyrenochaetic acid D和兩個已知化合物pyrenocine A，pyrenochaetic acid A。本文對土壤真菌CurvulariaaffinisHS-FG-196的代謝產(chǎn)物進行了進一步的研究，分離得到六個單體化合物pyrenocine S(1)、pyrenocine B(2)、pyrenocine E(3)、pyrenocine I(4)、pyrenochaetic acid B(5)和pyrenochaetic acid C(6)?；衔?～6的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。本文報道了化合物1～6的結(jié)構(gòu)鑒定及其體外抑制腫瘤細(xì)胞株A549、HCT-116、ACHN、K562和HepG2的活性。

圖1 Pyrenocine A,Pyrenocine J,Pyrenochaetic acid A,Pyrenochaetic acid D和化合物1～6的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of Pyrenocine A,Pyrenocine J,Pyrenochaetic acid A,Pyrenochaetic acid D and compounds 1-6

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

50 L發(fā)酵罐(上海國強生化工程裝備公司)； MULTIFUGE X3離心機(美國Thermo公司)；Agilent 1100型高效液相色譜(HPLC)儀，半制備ODS反相色譜柱(250 mm×9.4 mm)(美國Agilent公司)；Bruker-AVANCE400型核磁共振(NMR)儀(德國Bruker公司)；Thermo Finnigan-LCQ Advantage質(zhì)譜(MS)儀(美國Thermo公司)；M5酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)。

1.1.2 試劑

Doxorubicin(>99%，浙江海正藥業(yè)股份有限公司)；RPMI-1640 和DMEM/F-12 1∶1培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；胎牛血清(生工生物工程有限公司)；胰酶(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；PBS(美國GiBco公司)；Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒(DojinDo Laboratories)；DMSO(上海凌峰化學(xué)有限公司)；分析用甲醇、氯仿、乙醇、丙酮等購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；色譜用甲醇、乙腈購自美國Fisher公司。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面培養(yǎng)基

馬鈴薯200 g(去皮，切成小塊，加水煮沸30 min，4～6層紗布過濾，收集濾液)，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，用水定容至1 000 mL，120 ℃高壓滅菌 20 min。

1.2.2 種子培養(yǎng)基

土豆淀粉30 g，葡萄糖 40 g，蛋白胨 4 g，MgSO4·7H2O 1 g，KH2PO42 g，用水定容至1 000 mL，120 ℃高壓滅菌 20 min。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

土豆淀粉(1.0%)，葡萄糖(0.4%)，蛋白胨(0.2%)，酵母提取物(0.2%)，MgSO4(0.2%)，CaCl2(0.1%)，pH 7.8，高壓滅菌 20 min。

1.3 菌株

產(chǎn)生菌由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)張?zhí)煊罱淌谔峁?006年，該菌株由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士研究生張偉分離自吉林省白河市土豆地土壤，并鑒定其為C.affinis(菌株編號為HSAUP044489)。[11]目前，該菌株保存在浙江海正藥業(yè)股份有限公司中央研究院，菌種鑒定保藏室，菌株編號為HS-FG-196。

1.4 細(xì)胞株

人肺癌細(xì)胞株A549，人肝癌細(xì)胞株HepG2，人宮結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116，人腎癌細(xì)胞株ACHN和白血病細(xì)胞K562均購自武漢大學(xué)。

2 實驗方法

2.1 菌株發(fā)酵

取保存的菌株斜面，挑取適量菌絲或孢子，接種至斜面培養(yǎng)基上，于28 ℃，活化培養(yǎng)5天。將斜面培養(yǎng)物接入種子培養(yǎng)基，溫度30 ℃，于250 rpm搖床上培養(yǎng)約4天，然后將種子液按照10%的接種量接入裝有30 L發(fā)酵培養(yǎng)基的50 L發(fā)酵罐中，溫度28 ℃，通氣量1 m3·h-1，轉(zhuǎn)速100 rpm，發(fā)酵周期為7天，最后得到發(fā)酵液30 L。

2.2 提取與分離

30 L發(fā)酵液經(jīng)過離心得到菌絲體及上清液。其中菌絲體用5.0 L甲醇(MeOH)浸泡過夜，過濾得甲醇提取液；上清液上Diaion HP-20樹脂柱，上完樣后先用水洗滌，然后用95%乙醇(EtOH)洗脫，并收集乙醇洗脫液。合并所得甲醇提取液及乙醇洗脫液，在45 ℃減壓濃縮至干，得到總浸膏55.0 g。

總浸膏經(jīng)硅膠柱層析(100～200目)，以CHCl3/ CH3OH(90∶10～50∶50)梯度洗脫，分別收集流分。各流分經(jīng)過薄層層析檢測，合并得到3個部分Fraction-1，F(xiàn)raction-2和 Fraction-3。再將每部分經(jīng)過Sephadex LH-20凝膠柱層析，得到對應(yīng)的三個組分Subfraction-1，Subfraction-2，和Subfraction-3。此3個組分再用半制備高壓液相(semi-preparative HPLC)進行反相色譜分離，最后得到單體化合物。其詳細(xì)步驟如下：

Subfraction-1在以下條件進行反相色譜分離：洗脫劑(MeCN∶H2O=45∶55)，流速(1.5 mL/min)，檢測波長(λ= 254 nm)，收集保留時間為15.6 min的峰得到化合物1(15.7 mg)；收集保留時間為6.1 min的峰，然后其再經(jīng)過下列色譜條件進行純化 (洗脫劑(MeCN∶H2O=35∶65)，流速(1.5 mL/min)，檢測波長(λ= 254 nm)(，收集保留時間為17.1 min的峰得到化合物3(7.6 mg)。

Subfraction-2在以下條件進行反相色譜分離：洗脫劑(MeCN∶H2O=50∶50)，流速(1.5 mL/min)，檢測波長(λ= 254 nm)，收集保留時間為16.5 min的峰得到化合物6(11.7 mg)；收集6.6～8.7 min的峰，然后經(jīng)過下列色譜條件進行純化 (洗脫劑(MeCN∶H2O=25∶75)，流速(1.5 mL/min)，檢測波長(λ= 254 nm)(，收集保留時間為11.7 min的峰得到化合物2(55.0 mg)，收集保留時間為13.5 min的峰得到化合物4(4.3 mg)。

Subfraction-3在以下條件進行反相色譜分離：洗脫劑(MeCN∶H2O=40∶60)，流速(1.5 mL/min)，檢測波長(λ= 254 nm)，收集保留時間為8.6 min的峰得到化合物5(5.6 mg)。

2.3 體外抗腫瘤試驗

采用CCK8法測試所得化合物體外抑制A549、HCT-116、ACHN、K562和HepG2等腫瘤細(xì)胞株的活性。實驗流程參照已發(fā)表的文獻[12,13]。

3 結(jié)果

3.1 分離所得單體化合物性狀與結(jié)構(gòu)鑒定

紅外光譜顯示化合物1是一個α-吡喃酮類的化合物。將化合物1的核磁數(shù)據(jù)與已知化合物pyrenocine E的核磁數(shù)據(jù)[5]進行比較，結(jié)果顯示化合物1與pyrenocine E只是在C-3′位的一個連接基團不一樣，他們具有相似的結(jié)構(gòu)。pyrenocine E在C-3′位連接的是一個甲氧基(δH3.27,δC56.20)而化合物1連接的是一個乙氧基(δH3.36/3.57,δC64.0 和δH1.14,δC15.5)。通過1H-1H COSY,HMQC 和HMBC等2D NMR波譜可以進一步證明上述結(jié)果。在HMBC譜圖中(圖2)，H-3(δH5.49)與C-2，C-4和C-5，4-OCH3(δH3.87)與C-4及6-CH3(δH2.28)與C-5和C-6的相關(guān)性表明化合物1具有和pyrenocine E一樣的4-甲氧基-6-甲基-α-吡喃酮母核。1H-1H COSY譜圖中(圖2)3′-OCH2CH3′δH3.36,3.57)和3′-OCH2CH3′δH1.14)，H-3′(δH3.96)與H-4′(δH1.21)和H-2′(δH2.97,2.75)的相關(guān)性及HMBC譜圖中(圖2)H-3′和C-3′-OCH2CH3(δC64.0)，H-3′-OCH2CH3(δH3.36,3.57)和C-3′(δC71.9)，H-4′和C-2′(δC51.8)進一步確定了化合物1的結(jié)構(gòu)，如圖2所示。

圖2 化合物1的1H-1H COSY和HMBC相關(guān)圖Fig.2 1H-1H COSY and HMBC correlations of new compound 1

通過1H-1H COSY,HMQC 和HMBC等2D NMR波譜分析，對該化合物的全部碳信號和氫信號進行了歸屬(表1)。經(jīng)SciFinder網(wǎng)絡(luò)檢索，未發(fā)現(xiàn)相關(guān)報道，表明這是一個新的pyrenocines類化合物，我們將其命名為pyrenocine S。

化合物2白色固體(CHCl3)；1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ:5.50(1H,s,H-3),4.31(1H,s,H-3′),3.88(3H,s,H-4-OCH3),2,91 dd(1H,J=17.4,3.3 Hz,H-2′a),2.82 dd(1H,J=17.4,8.6 Hz,H-2′b),2.28(3H,s,H-6-CH3),1.24(3H,d,J=6.4 Hz,H-4′);13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ:163.8(s,C-2),87.8(d,C-3),168.3(s,C-4),56.5(q,C-4-OCH3),115.5(s,C-5),162.4(s,C-6),18.6(q,C-6-CH3),201.0(s,C-1′),52.8(t,C-2′),64.3(d,C-3′),22.8(q,C-4′);ESI-MS:m/z227 [M + H]+。以上數(shù)據(jù)與文獻[1,3]報道一致，鑒定化合物2為pyrenocine B。

表1化合物1的氫譜和碳譜

Table 11H(400 MHz)and13C(100 MHz)NMR data of new compound1in CDCl3

No.13C1H(ppm,J in Hz)2162.7 s-387.6 d5.49 s(1H)4168.4 s-4-OCH356.4 q3.87 s(3H)5116.0 s-6163.5 s-6-CH318.4 q2.28 s(3H)1′199.4 s-2′51.8 t2.97 dd(1H,16.0,8.3)2.75 dd(1H,16.0,4.7)3′71.9 d3.96 m(1H)3′-OCH2CH364.0 t3.57 m(1H);3.36 m(1H)3′-OCH2CH315.5 q1.14 t(3H,7.0)4′19.6 q1.21 d(3H,6.2)

化合物3白色固體(CHCl3)；1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ:5.48(1H,s,H-3),3.86(3H,s,H-4-OCH3), 3.83(1H,m,H-3′), 3.27(3H,s,H-3′-OCH3),2.94 dd(1H,J=16.0,8.3 Hz,H-2′a),2.74 dd(1H,J=15.9,4.7 Hz,H-2′b),2.25(3H,s,H-6-CH3),1.19(3H,d,J= 6.1 Hz,H-4′);13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ:163.5(s,C-2),87.6(d,C-3),168.4(s,C-4),56.4(q,C-4-OCH3),115.9(s,C-5),162.6(s,C-6),18.3(q,C-6-CH3),199.4(s,C-1′),51.6(t,C-2′),73.7(d,C-3′),56.2(q,C-3′-OCH3),18.9(q,C-4′);ESI-MS :m/z241[M + H]+。以上數(shù)據(jù)與文獻[5]報道一致，鑒定化合物3為pyrenocine E。

化合物4白色固體(CHCl3)；1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ:6.23(1H,d,J= 16.1 Hz,H-1′), 5.98(1H,dd,J= 16.1,6.0 Hz,H-2′),5.48(1H,s,H-3),4.45(1H,s,H-3′),3.83(3H,s,H-4-OCH3),2.32(3H,s,H-6-CH3),1.36(3H,d,J= 6.4 Hz,H-4′);13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ: 163.8(s,C-2),87.8(d,C-3),170.2(s,C-4),56.1(q,C-4-OCH3),110.1(s,C-5),163.8(s,C-6),18.4(q,C-6-CH3),118.4(d,C-1′),139.9(d,C-2′),69.0(dzhuzhu,C-3′),23.5(q,C-4′);ESI-MS:m/z211 [M + H]+。以上數(shù)據(jù)與文獻[6]報道一致，鑒定化合物4為pyrenocine I。

化合物5白色固體(CHCl3)；1H NMR(CD3SOCD3,400 MHz)δ:13.14(1H,s,H-1-COOH),7.44(1H,s,H-6),7.40(1H,s,H-2),4.08(1H,m,H-3′),3.84(3H,s,H-3-OCH3),2.20(3H,s,H-5-CH3),2.82(2H,m,H-2′),1.12(3H,d,J=6.2 Hz,H-4′);13C NMR(CD3SOCD3,100 MHz)δ: 135.0(s,C-1),167.2(s,C-1-COOH),109.7(d,C-2),156.3(s,C-3),56.3(q,C-3-OCH3),132.6(s,C-4),136.0(s,C-5),18.9(q,C-5-CH3),124.3(d,C-6),206.0(s,C-1′),53.9(t,C-2′),63.3(d,C-3′),24.2(q,C-4′);ESI-MS:m/z251[M-H]-。以上數(shù)據(jù)與文獻[4]報道一致，鑒定化合物5為pyrenochaetic acid B。

化合物6白色固體(CHCl3)；1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ:11.06(1H,br s,H-1-COOH),7.59(1H,s,H-6),7.47(1H,s,H-3),3.87(3H,s,H-3-OCH3),2.75(2H,m,H-2′),2.27(3H,s,H-5-CH3),1.73(2H,m,H-3′),0.99(3H,t,J=7.4 Hz,H-4′);ESI-MS:m/z235 [M-H]-。以上數(shù)據(jù)與文獻[4]報道一致，鑒定化合物6為pyrenochaetic acid C。

3.2 體外抗腫瘤活性

以A549、HCT-116、ACHN、K562和HepG2腫瘤細(xì)胞株為模型，用CCK-8法對本菌所得化合物1～6、pyrenocine J、pyrenochaetic acid D、pyrenocine A和pyrenochaetic acid A的細(xì)胞毒活性進行了初步評價，結(jié)果顯示化合物1、2、3、pyrenocine A和pyrenochaetic acid A對腫瘤細(xì)胞A549、HCT-116、ACHN、K562和HepG2表現(xiàn)出較強的活性；其余化合物對上述腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出較弱的活性。活性結(jié)果見表2。

4 討論

本文對一株分離自土豆根部的土壤真菌C.affinisHS-FG-196的次級代謝產(chǎn)物進行了再研究，共分離得到六個單體化合物(1～6)，利用各種波譜學(xué)方法結(jié)合理化性質(zhì)分析鑒定了所有化合物的結(jié)構(gòu)，其中化合物1為新化合物。在對其進行抗腫瘤活性評價中，我們發(fā)現(xiàn)化合物1、2、3、pyrenocine A和pyrenochaetic acid A對腫瘤細(xì)胞A549、HCT-116、ACHN、K562和HepG2表現(xiàn)出較強的活性；化合物4～6、Pyrenocine J 和Pyrenochaetic acid D對上述腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出較弱的活性。在具有相同母核條件下，化合物活性相差較大，因此，化合物抗腫瘤活性與其側(cè)鏈關(guān)系緊密。其中pyrenocines A和pyrenochaetic acid A的側(cè)鏈(E)-but-2-en-1-one與globosumone A的側(cè)鏈[14]非常相似，而且他們的活性強于其各自具有相同母核的化合物[14-16]。因此，我們推測(E)-but-2-en-1-one是一個抗腫瘤活性官能團。

表2 化合物1～6的細(xì)胞毒活性數(shù)據(jù)

注：aND表示未檢測；b陽性對照藥物；c數(shù)據(jù)已發(fā)表在參考文獻10。

Note：aND:No detection；bPositive control drug；cData have been reported in Ref.10.