黔產毛蒟揮發油對油酸致大鼠急性肺損傷的影響及其機制

丁雁南，楊 艷，李 姣

1遵義醫學院藥學院，遵義 563099；2遵義醫學院附屬醫院藥劑科，遵義 563003

毛蒟Piperpuberulum(Benth.) Maxim是一種胡椒科胡椒屬植物，具有芳香氣味，其普遍含有揮發油[1]。有研究表明胡椒根揮發油在鎮痛、抗炎和鎮靜中具有重要作用[2]，然而目前關于黔產毛蒟揮發油的抗炎活性還缺乏相關研究。急性肺損傷主要是由于機體在受到嚴重創傷、感染、休克等打擊后發生的肺毛細血管內皮細胞和肺泡上皮細胞損傷，導致肺泡和肺間質的水腫，進而發生進行性低氧血癥或呼吸衰竭[3]。急性肺損傷后機體內的肺泡巨噬細胞脂肪含量會明顯增加，同時血液中油酸水平也會發生明顯升高[4-7]。在急性肺損傷模型中多采用油酸誘導的急性肺損傷[8]。有研究顯示，p38MAPK信號通路在脂多糖、高氧以及油酸等誘導的動物肺損傷中起著重要作用[9]。p38MAPK 信號通路和炎癥反應有著密切關系，炎癥刺激可激活p38MAPK，而p38MAPK也可以調節 TNF-α、IL-1、IL-6 等致炎因子與 IL-12 等抗炎因子的生成，影響生物體內致炎與抗炎因素的平衡，從而決定炎癥進程。故本實驗采用油酸誘導大鼠急性肺損傷模型，觀察炎性介質、肺血管通透性指標、p38MAPK信號通路等指標的變化以及采用黔產毛蒟揮發油干預后對其產生的影響，探討黔產毛蒟揮發油對油酸致大鼠急性肺損傷的影響及其機制，并為臨床上急性肺損傷的防治提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗藥物

黔產毛蒟由遵義醫學院生藥學教研室楊建文教授鑒別，黔產毛蒟揮發油由遵義醫學院藥劑學教研室自制。稱取經粉碎的黔產毛蒟藥材適量，置于圓底燒瓶中，按一定料液比(藥材質量/去離子水體積，g/mL)加入去離子水和沸石若干，搖勻，浸泡一定的時間。連接好揮發油提取器及球形冷凝管，從冷凝管的上端加水至揮發油提取器中，直至充滿蒸餾水并幾乎溢流到圓底燒瓶為止。打開控溫電熱套進行加熱，加熱至第1 滴液滴從冷凝管管口滴下時開始計時，并始終保持微沸。微沸一定時間后停止加熱，放置片刻，開啟揮發油提取器下端的活塞，將水緩緩加入到油層下端至0 刻度線上5 mm處，再放置一段時間，繼續放水使油層下降到下端與0 刻度線平行，準確讀取揮發油的體積。收集該揮發油，用無水硫酸鈉脫水，置于-18 ℃冰箱中保存，備用。計算揮發油的提取率。

揮發油提取率(%)=毛蒟揮發油體積(mL)/毛蒟質量(g)×100%

1.2 動物

清潔級雄性成年SD大鼠，由第三軍醫大學動物實驗中心提供，體重為220±20 g，動物合格證號：002569。實驗動物被安置在一個12 h的光線與黑暗循環交替的溫度控制的環境，按實驗室標準自由地隨意飲食和水。實驗由第三軍醫大學動物管理與使用委員會批準，并遵照實驗動物管理與使用指南進行。

1.3 試劑

油酸購于Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)(批號：1001154572)；大鼠TNF-α酶聯免疫法試劑盒(批號：206384725)；考馬斯亮藍法蛋白測定試劑盒(批號：206393763)和Polink-2plus免疫組化檢測試劑盒(批號：206374335)購自碧云天生物技術有限公司。兔抗p38MAPK(批號：109535)；p-p38MAPK(批號：109243)和山羊抗GAPDH多克隆抗體(批號：109724)購自美國Abcam公司。

1.4 儀器

721型紫外-可見分光光度計(中國上海申化儀表自控公司)；-80 °C低溫冰柜(德國Forma Scientic公司)；Milli QA純水處理器(美國Millipore公司)；3K30型高速冷凍離心機(德國Sigma公司)；電子分析天平(中國北京賽多利斯電子天平有限公司)、凝膠成像儀(美國BioRad公司)；轉移槽(美國Bio-Rad公司)；蛋白電泳槽(美國Bio-Rad公司)。

1.5 方法

1.5.1 動物模型和分組

將SD大鼠按照體重隨機分為5組，每組為10只。對照組:經右側頸靜脈注入生理鹽水(normal saline，NS) 0.2 mL/kg,30 min后再注射NS 0.2 mL/kg。油酸組：經右側頸靜脈注入油酸0.2 mL/kg，復制大鼠急性肺損傷模型，建模前30分鐘從靜脈注射NS(劑量與毛蒟揮發油組中的毛蒟揮發油的液體劑量一致)。毛蒟揮發油組(0.125、0.25、0.5 mL/kg)：經右頸靜脈注射油酸0.2 mL/kg建立急性肺損傷模型前30 min，根據不同分組從頸靜脈注入毛蒟揮發油0.125、0.25、0.5 mL/kg。動物于實驗8 h前禁食，4 h前禁水，3.5%水合氯醛溶液1 mL/100 g腹腔注射麻醉，麻醉成功后經右頸靜脈注入油酸建模，3組實驗動物均于建立模型后4 h頸動脈放血處死，采集血標本進行血氣分析。

1.5.2 血氣分析和呼吸頻率測定

采用NOVA血氣分析儀檢測各組大鼠中動脈血血氣分析值，包括pH、PaCO2和PaO2等。

1.5.3 右下肺濕干重比值和肺系數的測定

在處死大鼠后，取出肺臟并稱重，肺系數=肺重量/體重×100%；然后將右下肺置于80 ℃的恒溫烤箱烘烤3天后稱重，右下肺濕干重比值=右下肺濕重/干重。

1.5.4 肺通透指數測定

在處死大鼠后，留取血清標本并測量其蛋白含量，然后收集支氣管肺泡灌洗液，并采用考馬斯亮藍法測定其蛋白含量，肺通透指數=支氣管肺泡灌洗液蛋白/血清蛋白。

1.5.5 支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和IL-1β炎癥因子含量的測定

采用ELISA法檢測支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和IL-1β炎癥因子的水平，在收集各組支氣管肺泡灌洗液后，使用ELISA試劑盒檢測各炎癥因子的濃度，并嚴格按照試劑盒使用說明書操作，并使用酶標儀檢測于450 nm的吸光值，并根據標準曲線計算支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和IL-1β的濃度。

1.5.6 病理學檢測

將大鼠右肺上葉取出后，采用生理鹽水漂洗，4%多聚甲醛固定，48 h后進行脫水、石蠟包埋、切片制成5 μm厚度切片，經脫蠟按照蘇木精-伊紅染色步驟染色后于光學顯微鏡下觀察肺組織的病理學形態改變并拍照。

1.5.7 肺組織p-p38MAPK免疫組化測定

肺組織切片、3% H2O2孵育10分鐘，PBS沖洗、加入兔抗p-p38MAPK一抗(1∶50)，4 ℃過夜，加入HRP標記抗兔IgG二抗，37 ℃孵育20 min，DAB顯色，然后采用蘇木素復染、脫水、透明、封片。

1.5.8 Western blot

取肺組織100 mg，加入2 mL單去污劑細胞裂解液，離心后取上清。采用考馬斯亮藍法檢測蛋白濃度后進行免疫印跡檢測。兔抗p-p38MAPK和p38MAPK為一抗(1∶50)。采用Quantity one ChemiDocXRS系統進行圖像采集和分析。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 血氣分析和呼吸頻率的測定

與對照組相比，油酸組大鼠呼吸頻率增快，PaO2及氧合指數均降低(P<0.01)；毛蒟揮發油組相比油酸組PaO2及氧合指數均明顯升高(P<0.01)。這說明毛蒟揮發油組有明顯的肺保護作用。詳見表1。

表1 各組大鼠RR，PaO2和PaO2/FiO2比較

注：與模型組比較**P<0.01 (下同)。

Note:Compare with volatile oil model group,**P< 0.01(similarly hereinafter).

2.2 右下肺濕干重比、肺系數和通透指數的比較

油酸組中右下肺濕干重比、肺系數和肺通透指數比對照組均明顯增加(P<0.01)。毛蒟揮發油組相比油酸組右下肺濕干重比、肺系數和肺通透指數均明顯減少(P<0.01)(見表2)。

2.3 支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子含量的比較

油酸組支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和IL-1β炎癥因子含量較對照組明顯升高(P<0.01)；毛蒟揮發油組相比油酸組肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和IL-1β炎癥因子含量明顯下降(P<0.01)(見表3)。

2.4 肺組織病理學改變

與對照組比較，油酸組光鏡下可見明顯肺泡和肺間質水腫、中性粒細胞浸潤和肺組織結構破壞，然而在毛蒟揮發油組(0.125 mL/kg)中可見其肺泡和肺間質水腫、中性粒細胞浸潤和肺組織結構破壞均明顯減輕(見圖1)。

表2 各組大鼠右下肺濕干重比值和肺系數的比較

表3 各組大鼠BALF中TNF-α、IL-6和IL-1β含量的比較

圖1 肺組織病理改變(HE×100)Fig.1 Histopathological changes of lung tissue in three groups(HE×100),注：A為對照組，B為油酸組，C為毛蒟揮發油組(0.125 mL/kg)。Note:(A)Control group,(B)Oleic acid model group,(C) volatile oil group(0.125 mL/kg).

2.5 肺組織p-p38MAPK免疫組化改變

p-p38MAPK蛋白陽性反應在細胞胞核和胞漿中均有染色。在對照組中主要分布在氣道粘膜上皮和肺泡上皮細胞且陽性細胞少，詳見圖2A和2B；在油酸組中主要分布在氣道粘膜上皮、肺泡上皮細胞、炎癥細胞、內皮血管細胞等且陽性細胞多，詳見圖2C和2D；在毛蒟揮發油組(0.125 mL/kg)中陽性細胞較油酸組則明顯減少(見圖2E和2F)。

2.6 Western blot測定肺組織p38MAPK蛋白表達

油酸組p-p38MAPK蛋白相對表達量較對照組明顯升高(P<0.01)；毛蒟揮發油組相比油酸組p-p38MAPK蛋白相對表達量明顯下降(P<0.01)；各組間p38MAPK蛋白相對表達量無明顯差異(P>0.05)(見表4,圖3)。

圖2 肺組織p-p38MAPK免疫組化改變(A、C、E:IHC×200;B、D、F:IHC×400)Fig.2 Immunohistochemistry of lung tissue in three groups (A,C,E:IHC×200;B,D,F:IHC×400),注：A和B為對照組，C和D為油酸組，E和F為毛蒟揮發油組(0.125 mL/kg)。Note:(A and B) Control group,(C and D) Oleic acid model group (E and F),volatile oil group (0.125 mL/kg).

表4 各組大鼠肺組織p-P38MAPK相對含量比較

圖3 各組大鼠肺組織p-p38MAPK相對含量比較(p-p38MAPK/p38MAPK)Fig.3 The protein level of p38MAPK and p-p38MAPK in lung tissues

3 討論

油酸模型是急性肺損傷的經典模型，能夠在病因上模擬肺損傷情況[10]。本研究結果中，與對照組相比，大鼠頸靜脈注入油酸后出現了一系列病理變化，包括呼吸頻率明顯增快以及光鏡下顯微結構的明顯改變，在血氣分析方面，油酸組PaO2明顯下降，肺濕干重比值則明顯升高，以上結果與文獻報道[11]相符，說明成功建立油酸誘導急性肺損傷動物模型。

急性肺損傷在早期變化主要是肺泡上皮細胞和肺血管內皮細胞的損傷導致對蛋白和液體的通透性增強，從而發生肺泡內外液體失衡。有研究顯示這種通透性增強和肺血管內皮細胞的損傷密切相關。肺通透指數作為評價急性肺損傷肺泡水腫和肺損傷的重要指標[12]。在本研究中油酸模型組肺通透指數、肺濕干重比值和肺系數較對照組有明顯升高，這能夠體現油酸能夠增加肺血管通透性和肺水腫情況。

急性肺損傷中的炎癥反應和肺功能以及內皮細胞損傷密切相關。在致炎因素的刺激下，機體中炎癥細胞被激活，并促進TNF-α、IL-6和IL-1β等炎癥因子的釋放。TNF-α能夠介導中性粒細胞活化，并進一步促進炎癥反應導致肺組織損傷[13]。在本研究中油酸組支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和IL-1β炎癥因子含量較對照組明顯升高；毛蒟揮發油組相比油酸組肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和IL-1β炎癥因子含量明顯下降。這說明毛蒟揮發油能夠通過減少炎癥因子的釋放發揮肺損傷保護作用。

急性肺損傷和機體內多種信號通路的傳導有關，其中p38MAPK通路作為重要的炎癥通路在急性肺損傷中也發揮著重要作用[14]。研究顯示p38MAPK能夠被多種炎癥因子、脂多糖、油酸、蛋白合成抑制劑、應激刺激和細菌病原體等激活，然后參與細胞的炎癥反應、免疫調節和細胞凋亡[15]。Liu[16]等研究表明SB203580能夠通過NF-κB通路減輕了脂多糖誘導的動物肺損傷。

本研究中免疫組化結果顯示油酸組中p-p38MAPK蛋白陽性反應主要分布在氣道粘膜上皮、肺泡上皮細胞、炎癥細胞、內皮血管細胞等且陽性細胞多， 在毛蒟揮發油組中陽性細胞較油酸組則明顯減少。同時免疫印跡結果發現油酸組p-p38MAPK蛋白相對表達量較對照組明顯升高；毛蒟揮發油組相比油酸組p-p38MAPK蛋白相對表達量明顯下降。同時毛蒟揮發油組相比油酸組右下肺濕干重比、肺系數和肺通透指數均明顯減少。這說明黔產毛蒟揮發油對油酸型急性肺損傷有較好的肺保護作用；黔產毛蒟揮發油明顯減少油酸型急性肺損傷大鼠肺組織中的TNF-α、IL-6和IL-1β水平，表明油酸型急性肺損傷中，p38MAPK磷酸化參與了炎癥因子的表達，促進了肺損傷。

在外界因素的刺激下MAPKKK-MAPKK -MAPK能夠啟動細胞內信號傳導，介導ERK、蛋白酪氨酸激酶和p38絲裂原活化蛋白激酶的活化，進而促進TNF-α、IL-6和IL-1β等多種炎癥因子的釋放[17]。在本研究中油酸能夠激活肺損傷中肺細胞p38MAPK信號通路，然后促進多種炎癥因子釋放，而黔產毛蒟揮發油能夠通過阻滯p38MAPK信號通路進而減少炎癥因子釋放并發揮肺損傷保護作用。

總之，在油酸型急性肺損傷中，p38MAPK磷酸化明顯增加，采用黔產毛蒟揮發油治療后能夠明顯抑制p38MAPK的磷酸化，抑制肺損傷組織的炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β的釋放，減輕肺血管內皮細胞的損傷，對油酸型急性肺損傷有顯著的肺保護作用，表明黔產毛蒟揮發油通過抑制p38MAPK通路發揮作用。