小單胞菌屬次級代謝產物及其生物活性研究進展

楊星鵬，張志斌*，朱 篤,2*

1江西師范大學生命科學學院，江西省亞熱帶植物資源保護與利用重點實驗室，南昌 330022；2江西科技師范大學生命科學學院，江西省生物加工過程重點實驗室，南昌 330013

放線菌所產抗生素是天然活性產物的主要來源，在已報道的10 000多個天然活性化合物中有75% 產自鏈霉菌屬，其余大約25%來自稀有放線菌[1]，從小單胞菌屬發現天然活性物質占38.1%，位居稀有放線菌的首位[2]。小單孢菌是革蘭氏陽性稀有放線菌[3]，截至2016年已報道了61個種和7個亞種[4]，其所產次級代謝產物種類多樣，不僅能產生如鏈霉菌產生的氨基糖苷類、大環內酯類等化學結構類型的抗生素，還能產生抗腫瘤等高細胞毒活性的烯二炔類獨特化學結構的生物活性物質[5-8]。已從小單胞菌中分離到的許多著名抗生素如慶大霉素(Gentamicins)[9]、西索米星(Sisomicin)[10]和羅沙米星(Rosamicin)[11]等已被作為藥物廣泛使用。因此，利用小單孢菌并從中尋找和發現新的抗生素和其他生物活性資源對于拓寬我國天然化合物藥源問題具有重要意義。

近年來隨著產物分離技術和藥物篩選技術的不斷提高，一些結構新穎且活性良好的化合物相繼從小單胞菌代謝產物中分離得到，它們表現出抑菌、抗腫瘤、免疫抑制劑等方面的生物活性[12,13]。雖然已有對小單孢菌在新型抗菌藥物及抗腫瘤抗生素方面的研究，但有關小單孢菌活性代謝產物研究綜述報導不多[14]。為了更全面的了解小單胞菌屬代謝產物研究概況，更好地開發和利用小單胞菌天然產物資源，本文對2015年以來從小單胞菌中分離得到的次級代謝產物結構特征及其生物活性進行了綜述。

1 化合物結構類型

1.1 大環內酯類

大環內酯類化合物是一類具有大內酯環的化合物，該類化合物具有很好的抑菌、抗腫瘤和抗寄生蟲等生物活性，在抗生素藥物方面有重要應用[15,16]。近幾年從小單胞菌中分離到22個大環內酯類化合物，其中14個新化合物，從小單孢菌中發現新大環內酯類化合物比例較高。

Chun等[17]從海洋MicromonosporaharpaliSCSIO GJ089代謝產物中分離到大環內酯類化合物22-dehydroxymethyl-kijanolide(1)、 8-hydroxy-22-dehydroxymethyl-kijanolid(2)、Microsporanates A-F(3-8)、Tetrocarcin P(9)、Tetrocarcin A(10)，B(11)和 AC6H(12)，并通過核磁共振(NMR)和質譜(MS)技術鑒定了它們的結構，其中1-9為新化合物。Gong等[18]從另一株海洋MicromonosporacarbonaceaLS276的代謝產物中也分離到化合物10、12，以及5個新的大環內酯類化合物Tetrocarcin Q(13)、Tetrocarcin N(14)、Tetrocarcin H(15)、Arisostatin A(16)和Tetrocarcin F1(17)。上述研究結果表明，從海洋來源的小單孢菌中分離代謝產物具有出新率高的特點。

Maklamicin (18)是由Micromonosporasp.NBRC 110955產生的一個抗生素，其生物合成和聚酮合酶有關，Daduang等[19]在研究聚酮合酶作用相關的基因makC2時發現一個新化合物29-Deoxymaklamicin(19)。后續實驗證明化合物19是18生物合成途徑中的中間體，兩者結構的區別是化合物19的29號位上的CH2OH變成了甲基。

2017年，Ochoa等[20]從鼠海豚(Harborporpoise)腸道附生菌MicromonosporaauratinigraRLFI1036F的代謝產物中分離到大環內酯類化合物phocoenamicin(20)。2018年，Perez-Bonilla等[21]從加那利群島海洋沉積物來源的Micromonosporasp.CA-214671中也分離到化合物20，以及兩個新大環內酯類化合物Phocoenamicin B(21)和C(22)。

1.2 大環酰胺類

大環酰胺化合物結構上都具有酰胺鍵，而且結構與多肽相似，因其有很好的生物活性，在生物醫藥領域受到關注和重視。大環內酰胺類化合物在真菌、鏈霉菌次級代謝產物中分布廣泛，而從小單孢菌中分離報道不多，本文總結了近幾年從小單胞菌中分離的大環內酰胺類化合物，在已報道的9個化合物中經鑒定有8個為新化合物。

圖1 化合物1～22的化學結構Fig.1 The chemical structures of compounds 1-22

2015年，Christopher等[22]從海洋Micromonosporasp.RL09-050-HVF-A中分離得到3個新的大環酰胺類化合物Lobosamides A-C(23～25)。Hoshino等[23]將MicromonosporawenchangensisHEK-797和細菌TsukamurellapulmonisTPB0596共培養，從中分離得到1個新的大環酰胺類化合物Dracolactams B(26)。Nie等[24]通過Sephadex LH-20和HR-TOF-MS等方法從Micromonosporasp.FIM05328代謝產物中分離到新大環酰胺類化合物FW05328-1(27)，并確定了其結構。Williams等[25]將海洋Micromonosporasp.RJA4480進行固態培養，并用乙酸乙酯萃取附有菌體的固體瓊脂培養基，從中分離得到4個新化合物Sporalactam B (28)、Sporalactam A(29)、Rifamycin 1(30)和Rifamycin 2(31)。通過改變培養策略來拓寬次級代謝產物種類并提高產量是微生物培養的重要手段，上述利用共培養、固態發酵培養小單孢菌的方法也能為后期從發酵產物中分離新化合物提供好的思路。

圖2 化合物23～31的化學結構Fig.2 The chemical structures of compounds 23-31

1.3 醌類

醌類化合物是天然產物中一類比較重要的活性成分，隨著人們對微生物次級代謝產物研究的深入，從海洋小單孢菌代謝產物中分離得到一些結構新穎的醌類化合物主要為蒽醌類及其衍生物，它們表現出較好的抑菌、抗氧化、抗腫瘤、細胞毒性等生物活性。

Mullowney等[26]從越南東海Cát bà半島的海洋沉積物中分離得到Micromonosporasp.G039，從其代謝物中獲得3個醌類化合物lagumycin B(32)，dehydrorabelomycin(33)和 WS-5995 A(34)，其中化合物32的結構首次得到表征。Jiang等[27]從海洋Micromonospora.echinosporaSCSIO 04089中分離到含苯并芴結構的新化合物Nenestatin A (35)，該化合物具有和非典型角環素單體lomaiviticins相似的碳骨架，在體外驗證表達該化合物的生物合成基因簇時分離到其生物合成中間體homo-dehydrorabelomycin E(36)。

Yan等[28]從公共放線桿菌基因組數據庫中挖掘二炔類生物合成基因簇時，從MicromonosporayangpuensisDSM 45577中分離得到一個帶烯二炔結構的蒽醌類化合物yangpumicin A(YPM A,37)和蒽醌類化合物YPM B-E(38～41)。Adnani等[29]將來自兩種不同的海洋生物的Micromonosporasp.WMMB-235和Rhodococcussp.WMMA-185共培養，從其代謝產物中分離到復雜結構的新的醌類化合物keyicin(42)。烯二炔類抗生素具有很強的抗腫瘤活性，而且作用機制新穎，能發展成新型高效的抗腫瘤藥物[30-32]，天然來源的烯二炔類化合物至今發現不多，從小單胞菌中發現的尤為稀少。

圖3 化合物32～42的化學結構Fig.3 The chemical structures of compounds 32-42

1.4 肽類

多肽化合物具有多種多樣的生理活性和藥用價值，是抗生素研究中的一個相對較新的領域，在小單胞菌中發現較多的是雜環肽類化合物。Yasushi等[33]將Micromonosporasp.ATCC 39149進行液態發酵，直接對整個發酵液進行HPLC和LC-ESI-MS分析，從中分離得到新的多肽ketomemicin A(43)。2016年Xu等[34]從中國云南的土壤樣品中分離得到Micromonosporasp.CPCC 202787 ，并在菌體的乙酸乙酯萃取相中發現10個多肽化合物44～53，其中化合物44和45為新化合物。

1.5 生物堿類

生物堿是一類重要的含氮雜環化合物，具有復雜多樣的化學結構和非常廣泛的生物活性,如抗菌、抗寄生蟲、抗腫瘤或細胞毒性[35]。自然界中生物堿主要來源于植物,在微生物中也有大量產生，目前從不同來源的放線菌中分離到越來越多具有獨特化學結構和生物學活性的生物堿。Hoshino等[23]將分離自湖泊沉積物的M.wenchangensisHEK-797和細菌T.pulmonisTPB0596共培養，獲得一個新的生物堿類化合物Dracolactams A(54)，證明共培養條件下一些沉默基因被激活可能產生新的代謝產物。Boonsnongcheep等[36]從葛根根瘤內生Micromonosporasp.PC1052分離到生物堿類化合物S-adenosyl-N-acetylhomocysteine(55)，化合物55首次從小單胞菌中分離得到，此前該化合物作為化學合成的產物已有報道。

圖4 化合物44～53的化學結構Fig.4 The chemical structures of compounds 44-53

Mullowney等[26]從海洋Micromonosporasp.G039除了發現三個醌類化合物lagumycin B (32)，dehydrorabelomycin(33)和 WS-5995 A(34)外，還發現了一個具有非特異性的細胞毒性生物堿phenanthroviridone(56)。Talukdar等[37]利用氯仿萃取從土壤中分離的MicromonosporaauratinigraHK-10的發酵液，并從油性粗提物中分離獲得一個新的醌類化合物2-methylheptylisonicotinate(57)。Nie等[24]使用1D,2D NMR和HR-TOF-MS對海洋Micromonosporasp.FIM05328的主要代謝產物進行了鑒定，發現了一個生物堿類化合物aurodox(58)。Dashti等[38]從來源于地中海海綿的Micromonosporasp.RV43經GlcNAc誘導后分離到一個新的生物堿類化合物3-formylindole(59)。Vizcaíno等[39]從來自2000米深的海洋沉積物的MicromonosporamatsumotoenseM-412中分離到一個生物堿類化合物，經HRMS(高分辨質譜)和1D、2D NMR確定結構鑒定后發現是保洛霉素家族化合物，并命名為paulomycin G(60)。Zhang等[40]從中國南海分離得到MicromonosporarosariaSCSIO N160，通過對發酵液丙酮萃取，樹脂吸附等幾個分離純化步驟之后，獲得3個新的生物堿類化合物Pyrazolofluostatins A-C(61～63)。

圖5 化合物54～63的化學結構Fig.5 The chemical structures of compounds 54-63

1.6 萜類

萜類化合物通常是指由異戊二烯單位組成的分子式為(C6H5)n的碳氫化合物，種類豐富，是天然產物中最大的家族[41]。萜類化合物廣泛分布在植物中，從小單胞菌中發現的萜類化合物相對較少。Mullowney等[26]在篩選抑制人腫瘤細胞系NCI-60 SKOV3的放線菌時，篩選到高活性菌株Micromonosporasp.G039并從其發酵液中分離到1個新的化合物isopimara-2-one-3-ol-8,15-diene(64)。Zhang等[42]從來自于海洋海鞘Symplegmabrakenhielmi的Micromonosporasp.WMMC-218中分離到2個新的雙萜類化合物Micromonohalimane A (65)和B(66)。

圖6 化合物64～66的化學結構Fig.6 The chemical structures of compounds 64-66

1.7 其它類型化合物

近幾年，國內外對小單孢菌活性產物的研究報道日益增多，除以上報道的化合物結構類型外，還包括脂肪酸類、酚酸類等，它們也具有一定的生物活性。Gao等[43]從海洋來源的Micromonosporasp.HS-HM-036中分離得到一種萘丙酸類似物(67)。來源于海綿的Micromonosporasp.RV43在不添加GlcNAc的情況下分離得到glutaric acid(68)、4-hydroxyphenyl acetic acid(69)、4-hydroxybenzoic acid(70)、4-hydroxybenzaldehyde(71)、3-hydroxybutyrate的不同類似物(72～77)，添加GlcNAc后產生了新化合物guaymasol(78)[38]。

Appadurai等[44]從來自海洋沉積物中的Micromonosporasp.ICN36中分離出一種具有高效抗MRSA活性的化合物，其結構暫未見報道。Diogo等[45]對MicromonosporaechinosporaDSMZ 43816培養物中的揮發性成分進行GC/MS分析，發現了一類新的長鏈脂肪腈族化合物。

圖7 化合物67～78 的化學結構Fig.7 The chemical structures of compounds 67-78

2 生物活性

2.1 抗菌活性

近幾年來，諸多學者對小單胞菌所產次級代謝產物的抑菌活性進行了研究，發現許多化合物對大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、白色念珠菌(Candidaalbicans)等常規指示菌有較好的抑制活性，同時還發現一些能作用于結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的化合物。

Gui等[17]從M.harpaliSCSIOGJ089分離得到9個大環內酯類活性化合物(3～12)，它們對蘇云金桿菌 BT01 和枯草芽孢桿菌 BS01 具有較好的抗菌活性，其MIC值為0.016～8.0 μg/mL，其中化合物3和10活性最強，對BT01和BS01的MIC值分別為0.016 μg/mL和0.03 μg/mL。Gong等[18]從M.carbonaceaLS276中分離到6個活性化合物(10,12～16)，化合物10、12～16對枯草芽孢桿菌的MICs 值分別為<0.048 μM、0.5 μM、12.5 μM、1.562 μM、50 μM 和0.048 μM。Mercedes等[21]報道3個大環內酯類活性化合物(20～22),化合物20、21和22質量分別為4、2、4 μg時抑制枯草芽孢桿菌的抑菌圈達7 mm，同時發現化合物20對結核分枝桿菌(Mycobacterium.tuberculosis)和耐萬古霉素的屎腸球菌(EnterococcifaeciumMB5571)也有抑制作用，其MIC值范圍在16～32 μg/mL和32～64 μg/mL之間。此外，大環酰胺類化合物28能很好地抑制結核分枝桿菌，其MIC90值為0.06 μM，有開發成新的抗結核藥物的潛能[25]。

Zhang等[40]發現生物堿類化合物61～63對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和白色念珠菌都有不同程度的抑制活性。Diogo等[45]對M.echinosporaDSMZ 43816培養物中的揮發性成分進行GC/MS分析，發現了一類新的長鏈脂肪腈族化合物并研究了其生物合成途徑，生物活性檢測表明其中某些化合物對Bacillussubtilis,Micrococcusluteus和 multiresistantStaphylococcusaureus(MIC=2.0～4.0 mg/mL)有一定的抑制活性。

隨著新的抗菌藥物的不斷出現和臨床應用，細菌的耐藥性已成為抗感染治療面臨的一個嚴重問題。從小單胞菌中分離到一些新的大環酰胺類化合物、醌類化合物和萜類化合物，它們對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSS)具有一定的抑制活性。化合物18是Micromonosporasp.NBRC 110955產的一個抗生素，能有效抑制金黃色葡萄球菌生長，MIC值為13 μg/mL，Daduang等在研究化合物18的合成過程發現一個合成途徑中的中間體化合物19，但是化合物19對金黃色葡萄球菌的MIC值為1.6 μg/mL，遠低于化合物18，化合物18對藤黃微球菌、枯草芽胞桿菌、蠟樣芽胞桿菌和糞腸球菌同樣有很強的抑制作用，MIC值在0.2～13 μg/mL之間[19,46]。化合物20～22對MRSA都有抑制作用，其中化合物20抑制作用最強，MIC值為1.0 μM，化合物21和22分別為4～8 μg/mL和32～64 μg/mL[21,22]。化合物28～31對多種不同病原菌(包括MRSA)都有很強的抑制作用。化合物28和29對MRSA的MIC90分別為7.0和1.8 μM，化合物30和31中的3-氨基取代基(R1)顯著增強了利福霉素支架的體外抗菌活性，對MRSA的MIC90值為0.000 8和0.000 9 μM，對E.coil、M.tuberculosis的MIC90值在0.000 1～1.8 μM之間[25]。該類化合物具有很好抗菌活性，有望成為新藥開發的前體化合物。化合物42[29]能抑制MSSA，MICS值為2.5 μM，對枯草芽孢桿菌的MICS值為9.9 μM，化合物42同時具有抑制分枝桿菌和紅球菌的活性。Talukdar等[37]發現具有廣譜抑制活性的化合物2-methylheptylisonicotinate (57)，該化合物對金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌、普通變形桿菌(Proteusvulgaris)、大腸桿菌、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和膿腫分枝桿菌(Mycobacteriumabscessus)的MIC值分別為70、40、80、60、60和50 μg/mL。化合物66[42]對MRSA有抑制作用，其MIC為40 μg/mL，化合物65對MRSA的MIC>200 μg/mL。化合物67[43]對枯草桿菌和銅綠假單胞菌的最小抑菌濃度分別為0.016 mg/mL和8 mg/mL。

2.2 抗腫瘤活性

天然化合物及其衍生物是抗腫瘤化合物的重要來源之一。具有細胞毒性的化合物能作用于細胞的基本結構或者生理過程，從而影響細胞的生存，在癌癥和腫瘤治療方面有重要的意義。細胞毒性實驗結果表明，小單孢菌的次級代謝產物具有比較明顯的抗腫瘤活性。Nie等[24]分離的新大環酰胺類化合物27顯示較好的細胞毒活性，對人腫瘤細胞系KYSE30、KYSE180和EC109有較好的抗增殖效果，其IC50值分別為15.92、30.77、0.000 20 μM。Mullowney等[26]以小鼠卵巢表面上皮(MOSE)和小鼠輸卵管上皮(MOE)為代表的卵巢癌前體細胞系，對化合物32、33、34和56進行了選擇性細胞毒性評價，化合物32對兩種細胞系的LC50分別為9.80 μM(MOSE)和10.8 μM(MOE)，化合物33和56為非特異性的細胞毒性，對多種癌細胞都有較強的抑制作用，化合物34對Kuramochi卵巢癌細胞的LC50為18.6 μM。Pang等[34]對化合物44～53進行了細胞毒性檢測，結果表明化合物44～53對Sup T1細胞具有相對較低的細胞毒性。化合物37[28]是1個帶烯二炔結構的蒽醌類化合物，其對黑色素瘤(SKMEL-5)、乳腺癌(MDA-MB-231 和SKBR-3)、中樞神經系統(SF-295)和非小細胞肺癌(NCI-H226)均表現出很高的抑制活性(IC50s=0.26～2.9 μM)，該研究結果與報道的烯二炔類化合物具有高細胞毒性和抗腫瘤活性是一致的。

Nie等[24]從海洋Micromonosporasp.FIM05328代謝產物中分離到有抑制腫瘤細胞增殖效果的化合物58，該化合物對人腫瘤細胞系KYSE30,KYSE180和EC109的IC50值為22.52 μM、83.76 μM和20.56 μM，對細菌和真菌沒有抑菌活性。化合物60[39]對人胰腺癌(MiaPaca-2)、乳腺癌(MCF-7)和肝細胞癌(HepG2)具有較強的細胞毒活性，IC50值分別為2.70±0.25 μM、1.58±0.12 μM和4.30±0.42 μM。化合物67[43]對人肺腺癌細胞株A549具有細胞毒性，IC50值為46.54 μg/mL。化合物79[44]在體外試驗中對HCT 15結腸癌細胞具有一定的殺傷活性，IC50值為8.28 μg/mL。

2.3 抗HIV活性

艾滋病(HIV)是一種免疫缺陷病，到目前為止仍然無法治愈，能對HIV病毒起到抑制作用的天然產物為數不多，僅包括多糖、萜類、生物堿、多肽等化合物中的少數幾種，和已報道的成千上萬種天然活性化合物相比是少之又少。最近有研究人員從小單胞菌中就發現一些能抑制HIV病毒的多肽類化合物，如化合物44和45對HIV-1的抑制作用較弱，IC50分別為58.0 μM和57.3 μM，而化合物46～53相對較強，IC50為5.3～22.3 μM[34]。以上研究表明多肽類化合物在抗HIV方面顯示較好的應用前景。

2.4 其他生物活性

小單胞菌次級代謝產物除了具有抗菌活性、抗腫瘤活性和抗HIV活性外，還具有抗寄生蟲活性和抗氧化活性等。研究人員發現化合物23和24對布氏錐蟲(Trypanosomabrucei)有明顯的抑制作用，其IC50分別為0.8 μM和6.1 μM[22]。化合物61[40]具有一定的抗氧化活性(EC50=48.6 μM)。本研究未報道其它代謝產物的抗寄生蟲和抗氧化等活性，在后續的研究工作中可以利用發酵調控的手段來提高代謝產物的產量，從而發掘其新的生物學功能。

3 結論與展望

小單孢菌分布廣泛，從陸地到海洋、從土壤到動植物，都有分離到小單孢菌的報道，通過本文統計，小單孢菌主要來源海洋(15個)、其次為土壤(2個)，分別占63%和8%(圖8A)。小單孢菌屬也是產新型抗生素和其他活性化合物的重要來源，本論文從小單胞菌屬中分離到79個次級代謝產物，新化合物(48個)占化合物總數的61%。從化學物結構類型看，大環內酯類相對較多(22個)，占化合物總數的28%，其后依次為醌類(11個)、肽類(11個)、生物堿(10個)和大環酰胺(9個)，分別占化合物總數的14%、14%、13%和11%(圖8B)。已報道的化合物中有52個具有生物活性，具有抑菌活性的最多(31個)，其次是抗腫瘤活性(19個)、抗HIV(10個)等，所占比率依次為67%、24%和13%(圖8C)。以上數據分析結果表明，小單胞菌是挖掘活性天然產物的重要菌源，所產次級代謝產物化學結構新穎、出新率高，生物活性研究具有其獨特的優勢，為尋找新的藥用先導化合物提供了寶貴的資源。

圖8 小單胞菌來源(A)、產物結構分類(B)和產物活性分類(C)Fig.8 Origin categories(A) of Micromonospora、Structure types(B) and Bioactive categories(C) of Micromonospora natural products

因此在充分利用現有小單胞菌資源的同時，我們可以從以下3個方面對小單胞菌及其次級代謝產物進行更全面的研究：(1)加大對研究相對較少的特殊生境小單胞菌的分離篩選，如海洋沉積物、動植物內生環境、極熱極冷環境，以獲得更為豐富的小單胞菌資源，為天然產物的分離和開發奠定基礎；(2)小單胞菌具有很強的產天然活性產物的潛力，但是在實驗室的培養條件下，很多天然產物的基因合成簇表達率低，甚至沉默。隨著生物信息學和分子生物學的深入研究，我們可以對菌株的基因進行深度地挖掘并研究其代謝通路，充分發揮小單胞菌代謝產物的合成潛力，以盡可能地獲得更多的天然代謝產物；(3)從小單胞菌中分離出來的天然產物，有許多都是結構十分相似的同類物質，但活性卻各有不同。因此，可以結合化學合成和結構修飾的方法，對現有天然化合物進行結構改造，開展構效關系研究，以從中發現藥物先導物或者藥物，為人類健康與醫藥的發展做出貢獻。