miRNA-32啟動子區域相互作用蛋白的分析*

吳巍蕓

(廣東醫科大學附屬醫院消化內科,廣東湛江 524001)

大腸癌是消化系統主要的惡性腫瘤之一。微RNA(miRNA)是一類長18～25 nt 的非編碼小分子RNA，廣泛參與了生物體多種生理病理過程，如個體發育，細胞增殖、凋亡和分化，代謝與應激反應的調節，腫瘤形成等，在疾病的診斷、治療、預測預后及藥物療效方面均具有巨大的潛力[1-2]。作者前期研究顯示，miRNA-32 在大腸癌組織表達較正常組織顯著上調，且與大腸癌淋巴結轉移及遠處轉移相關；生存曲線分析顯示，miRNA-32表達增高的患者預后較 miRNA-32 表達不增高的患者差[3-4]。體外研究發現，miRNA-32 過表達可以通過抑制靶基因第 10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物基因(phosphatase and tension homologue deleted on chromosome ten,PTEN)增強大腸癌細胞的增殖，減少凋亡，促進大腸癌細胞的遷移和侵襲等，參與大腸癌發生、發展過程[3-4]。但miRNA-32在大腸癌中的上調機制尚未清楚。本實驗通過DNA pulldown 技術聯合質譜鑒定的方法對 miRNA-32啟動子區域相互作用蛋白進行分析，進一步用生物信息學方法對相互作用蛋白進行 GO富集分析及 KEGG 通路分析，旨在揭示可能與miRNA-32啟動子存在相互作用的蛋白，以期為進一步研究miRNA-32表達調控的機制提供重要的信息。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株 人大腸癌細胞株HCT-116購自中國科學院細胞庫。

1.1.2主要試劑 高純度質粒小體中量試劑盒、Universal DNA純化回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；高保真Prime STAR DNA聚合酶試劑盒、DNA標記物購自Takara公司；快速銀染試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；Dynabeads?M-280鏈霉親和素購自Thermo公司；聚合酶鏈反應(PCR)引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2方法

1.2.1DNA pulldown 蛋白結合探針制備 PCR擴增miRNA-32所在的宿主基因TMEm245轉錄起始上游-1 987～-1 bp片段。上游引物：5′-CAG CCT GTT CAA CAT GGT GAA-3′，下游引物：5′- GTA ATG GGA GTC GGG CTA GAA AC -3′ 。并在上游引物 5′用生物素標記。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；循環參數分別為94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共35個循環；72 ℃充分延伸10 min，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增情況。Universal DNA 純化回收試劑盒純化、回收擴增的目的片段并測序鑒定。

1.2.2DNA pulldown實驗 HCT-116細胞于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，37 ℃，5% CO2環境中常規培養，細胞生長狀態良好時，RIPA裂解液裂解細胞，提取細胞蛋白。m280鏈霉素親和磁珠與上述生物素標記的DNA探針冰上孵育4 h結合(實驗組)，以無生物素標記的DNA探針-磁珠為陰性對照組。再往磁珠-DNA混合物中加入細胞裂解液(約含蛋白1 mg)，4 ℃孵育過夜。清洗緩沖液清洗磁珠-DNA探針-蛋白復合物，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白條帶并銀染。

1.2.3質譜鑒定和分析 將電泳條帶胰酶酶解成肽段，純化肽段后用質譜儀 Thermo Scientific Q Exactive 分析。質譜原始文件經過MM File Conversion軟件處理轉換，得到MGF格式文件，然后用MASCOT檢索uniprot數據庫。質譜鑒定及分析送廣州賽哲生物技術有限公司完成。

1.2.4差異表達蛋白GO、KEGG富集分析 對實驗組和陰性對照組比較篩選出的差異表達蛋白進行GO、KEGG富集分析。GO 富集包括細胞組成(cellular component)，分子功能(molecular function)及生物學過程(biological process)三方面內容。在生物體內，不同基因相互協調行使生物學功能，基于 KEGG 通路分析有助于更進一步了解基因生物學功能。GO富集與KEGG通路檢驗時，當P<0.05的GO功能條目及主要KEGG信號通路被認為是顯著富集。

2 結 果

2.1DNA pulldown獲取miRNA-32啟動子區域相互作用蛋白 用生物素標記的DNA探針-磁珠復合物pulldown能與DNA 相互作用的蛋白。pulldown后的樣品進行 SDS-PAGE分離，實驗組與陰性對照組相比存在蛋白條帶差異(input為陽性對照組)，見圖1。

M：DNA標記物；1：input；2：生物素標記探針實驗組；3：非生物素標記探針組(陰性對照組)

圖1DNApulldown實驗

表1 質譜分析實驗組與陰性對照組的差異蛋白

圖2 差異蛋白的GO富集分析

2.2質譜鑒定及分析 將實驗組及陰性對照組的電泳條帶送質譜鑒定及分析。去除與陰性對照組重復及未能鑒定的蛋白，共篩出191個差異蛋白，部分蛋白見表1。差異蛋白認為是能和miRNA-32啟動子區域相互作用的特異性蛋白。

圖3 差異蛋白的KEGG通路富集分析

2.3GO富集分析 通過GO富集分析注釋各差異蛋白的分子功能和生物進程。從分子功能上看，大部分蛋白質為結合(binding)蛋白質和具有酶活性的蛋白質。結合蛋白質包括蛋白結合、細胞骨架蛋白結合、酶結合、離子結合、RNA 結合蛋白質。酶活性蛋白質包括具有催化活性、甲基轉移酶活性、轉移酶活性的蛋白質。從生物學過程來看，這些蛋白質多參與核酸代謝、基因轉錄，蛋白代謝、修飾，核質運輸、細胞周期、細胞生長和再生等代謝過程，見圖2。

2.4KEGG通路富集分析 KEGG 分析顯示，各差異蛋白顯著富集于氧化磷酸化、氨基酸代謝、間隙連接、細胞周期等信號通路，還參與MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路、Ras通路、Toll樣受體信號通路等。以P<0.05為篩選條件時，這些差異蛋白共涉及24個顯著富集的通路，前20位富集通路，見圖3。

3 討 論

許多研究顯示，腫瘤中異常表達的miRNAs具有類似原癌基因或抑癌基因的功能，調控腫瘤細胞的增殖、分化和凋亡，在腫瘤發生、發展中發揮作用[5-6]。miRNAs在不同腫瘤中具有特定的表達模式。多個研究發現 miRNAs與大腸癌的發生、發展有關。PELLATT等[7]檢測了1 894例大腸癌組織，并與人正常結腸組織進行比較，發現其中有12種miRNA表達水平有明顯差異，包括 hsa-miRNA-663b、hsa-miRNA-4539、hsa-miRNA-17-5p等。與大腸腺瘤相比，大腸癌患者血清的miRNA-21明顯升高，且在根治性手術后水平下降，組織和血清中miRNA-21的高表達與腫瘤大小、遠處轉移、預后顯著相關，而且血清miRNA-21水平是大腸癌的一個獨立預后因素[8]。miRNA-140通過下調Smad3，抑制大腸癌細胞的增殖、轉移和侵襲能力[9]。作者前期研究發現，大腸癌中miRNA-32表達上調，且與靶基因PTEN結合，抑制其表達，參與大腸癌的發生、發展[3-4]。進一步探討miRNA-32在大腸癌中上調的機制。miRNA的正確轉錄由復雜的調控系統調節，轉錄因子與啟動子的相互作用是其重要的組成部分。外界環境的各種刺激或不同發育階段的各種信號會促使不同的轉錄因子與轉錄調控元件結合，激活或抑制miRNAs的轉錄。因此，確定miRNAs上游啟動子上的相互作用的蛋白并分析其功能對研究miRNAs的轉錄調控具有重要意義。JIANG等[10]研究發現，miRNA-378在人脂肪細胞中表達升高，通過熒光素酶報告基因檢測發現miRNA-378的啟動子區域在其上游-698 bp～-94 bp處，其中含有轉錄因子SREBP和C/EBP的結合位點，并通過EMSA實驗證實，初次報道了脂肪因子和細胞因子可能通過與人脂肪細胞的miRNA-378啟動子區域的SREBP和C/EBP結合位點結合，上調miRNA-378的表達。研究發現，心肌特異性表達的miRNA-1受到肌肉組織形成有關的轉錄因子SRF和MyoD的調節[11]；YIN等[12]發現，在卵巢顆粒細胞中，類固醇因子-1(SF-1)能與miRNA-383的啟動子區域結合，促進miRNA-383的表達。miRNA-32屬于基因內miRNA，其宿主基因為跨膜蛋白245(transmembrane protein 245,TMEm245)。miRNA-32位于TMEm245的第14個內含子中。研究發現，內含子編碼的miRNAs與它們的宿主基因共表達[13]，且它們產生在內含子剪接之前，顯示這些miRNAs和它的宿主基因mRNA來自于相同的轉錄本，所以調控這些miRNAs和它們相應的宿主基因表達應是相同的機制[14-15]。

本實驗在Ensembl數據庫中檢索TMEm245轉錄起始點上游約2.0 kb長度的區域，采用DNA pulldown技術聯合質譜分析的方法對啟動子區域相互作用蛋白進行分析，進一步用生物信息學方法對相互作用蛋白進行GO富集分析及KEGG通路分析。結果顯示，DNA pulldown和質譜分析總共鑒定到191個潛在的特異性與啟動子區域相互結合的蛋白。GO功能富集分析結果顯示，這些相互作用蛋白涉及多種生物學功能，包括參與核酸代謝、基因轉錄，蛋白代謝、修飾，核質運輸、細胞周期、細胞生長和再生等代謝過程等。KEGG通路分析結果表明這些相互作用蛋白參與多條細胞內重要的信號通路，包括間隙連接、細胞周期信號通路、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路、Ras通路、Toll樣受體信號通路等。這些信號通路在調控細胞增殖、分化、凋亡、遷移、侵襲等重要生理和病理過程中發揮重要作用。這為進一步研究大腸癌中miRNA-32上調及大腸癌發生、發展的機制提供了重要的信息。這些信息的預測為下一步尋找有意義的調控miRNA-32表達的蛋白提供了線索，但由于生物信息學具有一定的局限性，還需進行進一步的分子生物學及功能的驗證，這為下一步研究提供了可靠的研究策略。