貫筋藤多糖的提取及其單糖組分分析

施婭楠，謝文祥，陶亮，黃艾祥

（云南農業大學 食品科學技術學院，云南 昆明 650201）

貫筋藤（Dregea sinensis Hemsl.）[1]，為蘿藦科（Asclepiadaceae） 南山藤屬（Dregea E.Mey.，nom.cons.）植物，俗稱“奶漿藤”，生長于海拔2 000 m～3 000 m 山地森林中或山地林谷溝旁，主產于云南巍山、劍川、昆明，貴州等地，資源豐富，當地百姓利用風干貫筋藤水溶液作為凝乳劑生產民族食品乳餅，乳扇。黃艾祥等[2-6]對貫筋藤天然植物凝乳劑、蛋白酶，貫筋藤花營養成分、安全性進行了系列研究，中科院昆明植物研究所對貫筋藤中的小分子活性物質進行了分離鑒定[7-9]，關于貫筋藤多糖的研究未見相關報道。

根據《云南植物志》記載“貫筋藤全株藥用，防齲齒，止瀉抑菌，耐缺氧抗疲勞，對癲癇疾患有較好的療效”，是一種重要的藥用和食用資源[10]，目前大量的貫筋藤莖桿提取凝乳劑后直接丟棄，造成大量資源浪費，如莖稈中多糖，有機酸，萜類和黃酮等活性成分[8-9]。隨著多種真菌多糖、植物多糖被成功的開發和利用，如食用菇多糖、茯苓多糖、海藻多糖、鐵皮石斛多糖、金針菇多糖等[11-16]，多糖大量的活性功能也相繼報道，如調節機體免疫力、抗炎、抗氧化、降血糖及抗菌等有益生理活性以及極低的毒副作用[17-18]。本研究以貫筋藤的高值化利用出發，進一步提取多糖，并采用乙酸酐乙酰化衍生法對貫筋藤莖桿多糖中單糖組份進行定性研究，為云南地方資源的開發以及貫筋藤進一步活性功能的挖掘提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

貫筋藤鮮莖：采自云南大理州劍川縣，海拔2 000m～3 000 m 山地森林或灌木叢；標準單糖：Merck 公司；Beyotime 蛋白定量試劑盒：碧云天生物技術公司。

1.2 儀器與設備

7890A-5975c 氣質聯用儀：美國Agilent 公司；SpectraMax M5x 酶 標 儀 ：Molecular Devices 公 司 ；ProUV-1700 紫外可見光譜儀：日本島津公司；FD-1A-50 真空冷凍干燥機：上海比朗儀器有限公司；TDL-5-A 離心機：上海安亭科學儀器廠；RE-52A 旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；78-2 型磁力攪拌器：常州國華電器有限公司；Megafug e1.0R 型高速冷凍離心機：丹麥Heto 公司。

1.3 試驗設計

1.3.1 貫筋藤多糖樣品制備

貫筋藤莖稈取洗凈去雜物，敲碎浸提，過濾后減壓濃縮至原體積的四分之一，加入80%乙醇，醇沉24 h 后離心，沉淀用無水乙醇洗滌3 次，后水浴加熱，除去乙醇，弱堿性樹脂DEAE 纖維素脫色，三氯乙酸脫蛋白，透析、離心，最后用丙酮洗滌2 次，真空冷凍干燥得貫筋藤多糖。

1.3.2 單因素試驗

分別設置貫筋藤鮮莖料液比[1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）]，浸提溫度（50、60、70、80、90℃），浸提時間（20、40、60、80、100 min），以多糖得率為指標，研究各因素變量對貫筋藤莖桿中多糖提取率的影響。

1.3.3 正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上，選擇料液比（A）、浸提時間（B）、浸提溫度（C）為考慮因素，以貫筋藤粗多糖得率為參考指標，采用L9（34）正交表進行正交試驗，確定最佳提取工藝，各因素水平見表1。

表1 貫筋藤多糖提取工藝的正交試驗方案Table 1 Factor and levels for orthogonal experiment on extraction of polysaccharide from Dregea sinensis Hemsl.

2 檢測指標

2.1 貫筋藤理化分析

貫筋藤多糖得率/%=（多糖干品質量/原料質量）×100；苯酚-硫酸法測定總糖含量[19]；硫酸基含量采用硫酸鋇比濁法[20]；貫筋藤蛋白含量測定采用二氨基二甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白分析試劑盒。

2.2 定性分析

采用溶解試驗、茚三酮反應和碘-碘化鉀反應[21]。

2.3 貫筋藤多糖中單糖組分的氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析

2.3.1 多糖的水解

稱取貫筋藤多糖15 mg，加入3 mol/L 三氟乙酸10 mL，于120℃水解4 h，取出冷卻后，減壓蒸干，放置于干燥器中備用。

2.3.2 乙酰化衍生物的制備

取星蟲多糖水解后的干燥品8 mg，加入10 mg 鹽酸羥胺，0.5 mL 吡啶，于90℃油浴中反應30 min。加入0.5 mL 乙酸酐，在90℃油浴乙酰化30 min，反應產物減壓蒸干。用1 mL 的三氯甲烷充分溶解衍生物，0.22 μm有機濾膜過濾。取上層吡啶層進行GC-MS 分析。

2.3.3 單糖對照品衍生物的制備

同2.3.2中的方法制備對照品鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、果糖制備單糖乙酰化衍生物各1.0 mL。

2.3.4 空白溶液的制備

操作步驟同2.3.3，試管中不加多糖樣品。

2.3.5 色譜條件

按照劉玉明等[22]的GC-MS 參數并做適當修正：DB-5MS UI 毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為高純氦氣；汽化室溫度250℃；程序升溫，起始溫度100℃，以5℃/min 升至200℃，保持1 min，再以10℃/min 升至250℃，保持5 min；載氣流速1.0 mL/min，分流比20∶1，進樣量1 μL；接口溫度280℃；電離方式為EI；電子轟擊能量70 eV；溶劑延長時間5 min；全掃描范圍：50 m/z～800 m/z，選擇離子掃描。根據峰面積歸一化得單糖組成的相對質量分數。在上述色譜條件下，先將標準單糖衍生物混合液進樣，記錄色譜峰的保留時間、衍生物的峰位置，供試品溶液和空白溶液隨后進樣。

2.4 數據統計分析

分析結果以平均值±標準偏差表示，采用SPSS16.0軟件對數據進行統計。

3 結果與分析

3.1 不同浸提溫度下貫筋藤多糖的得率

浸提溫度對貫筋藤多糖得率的影響見圖1。

圖1 浸提溫度對貫筋藤多糖得率的影響Fig.1 Effect of temperature on the yield of polysaccharides from Dregea sinensis Hemsl.

由圖1可知，貫筋藤多糖最適提取溫度應控制在70℃，得率為6.91%，適宜的溫度有利于分子熱運動，增強傳質從而提高得率，溫度在80℃～90℃區間得率緩慢下降，多糖可溶物在溫度過高的情況下結構發生改變，導致溶解性降低。

3.2 不同浸提時間下貫筋藤多糖的得率

浸提時間對貫筋藤多糖得率的影響見圖2。

圖2 浸提時間對貫筋藤多糖得率的影響Fig.2 Effect of time on the yield of polysaccharides from Dregea sinensis Hemsl.

由圖2可知，浸提60 min 后，得率呈下降趨勢，貫筋藤粗多糖在提取液中趨于飽和，體系黏度變大，因而未溶出的多糖的傳質過程受到阻礙，溶出速率減慢；其次某些五碳環或六碳環因處理時間過長轉變單糖、寡糖或低聚糖裂解而溶于乙醇的，在醇沉過程中有所損失，因此選擇最適提取時間為60 min，多糖得率為7.00%。

3.3 不同料液比下貫筋藤多糖的得率

浸提料液比對貫筋藤多糖得率的影響見圖3。

圖3 料液比對粗多糖得率的影響Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on the yield of polysaccharides from Dregea sinensis Hemsl.

由圖3可知，在提取溫度70℃、提取時間60 min、料液比1∶20（g/mL）時，貫筋藤多糖的含量達7.03%，雖然未經過其他輔助提取，與其他物理單次提取藤莖類植物多糖文獻報道類似。原因是溶劑體積小時，多糖溶解不充分，隨著提取溶劑的增加，溶劑與莖稈的接觸面積增大，加快了多糖的溶出，其次多糖充分溶脹，也有利于多糖的溶出，但溶劑體積過大，使后續中的濃縮時間增加，必然使多糖在濃縮過程中有較多損失，反而使多糖得率下降。

3.4 貫筋藤莖中粗多糖提取最佳條件的確定

對提取溫度、提取時間和提取次數進行L9（34）正交試驗結果見表2。

表2 正交試驗結果及分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments

由表2極差R 的大小順序可知，影響貫筋藤粗多糖得率的各因素主次關系為：浸提溫度〉料液比〉浸提時間，最佳提取工藝為A2B2C3，即浸提溫度75℃，料液比1∶25（g/mL），浸提時間60 min。根據試驗結果進行方差分析，進行貫筋藤莖中粗多糖的提取試驗過程中，料液比、浸提溫度對貫筋藤粗多糖的得率影響p 值分別為0.010 9，0.048 2，0.030 6，均達顯著水平（p〈0.05），說明試驗數據可信。在此優化工藝條件下，重復試驗3 次，測得均總多糖的含糖量為7.04%。

3.5 貫筋藤多糖的理化性質

1）貫筋藤多糖脫色后呈灰白色粗粉狀，微甜澀味，具有植物清香和焦糖味，易溶于水，不溶于無水乙醇、丙酮、乙醚等有機溶劑。貫筋藤多糖可能含有酚型化合物而顏色較深，濃縮液經弱堿性纖維素樹脂脫色由棕色變為微黃的黏稠狀液體。2）碘-碘化鉀反應呈陰性，茚三酮反應呈弱陽性，說明可能為非淀粉性多糖、含有少量的氨基酸、多肽或蛋白質。

3.6 貫筋藤多糖的得率、總糖含量、硫酸基含量及貫筋藤蛋白含量

經提取工藝優化的貫筋藤多糖得率為7.04%。根據標準曲線：y=8.442 3x+0.015 9（R2=0.939）計算出多糖的總糖含量為16.7%。根據標準曲線：y=4.099 1x+0.009 1（R2=0.951）計算出多糖的硫酸基含量為0.17%。硫酸多糖是多糖分子鏈中單糖分子的部分羥基被硫酸基取代而形成的一類多功能活性物質，研究表明，多糖的許多生物活性功能與硫酸基含量（糖基所帶硫酸基的個數）有直接關系[23]。根據標準曲線和使用的樣品體積計算出貫筋藤莖稈的蛋白濃度，標準曲線：y=0.652 1x+0.133 4（R2=0.995），蛋白濃度為7.243 mg/mL。

3.7 貫筋藤多糖的單糖組成

多糖是由10個以上單糖通過糖苷鍵連接在一起，具有多個極性基團，不能直接揮發的大分子物質，因此進行氣相色譜分析時需將大分子多糖降解為具有易揮發，對熱穩定的單糖或寡糖衍生物，本研究所采用的鹽酸羥胺肟化和乙酸酐乙酰化衍生法能有效克服由于糖的異構體產生而造成的多峰現象，每種單糖都能獲得單一的色譜峰，利于進行氣相色譜的定性分析，貫筋藤多糖乙酰化衍生產物的GC-MS 圖譜見圖4。

混合標準單糖和貫筋藤多糖各峰的出峰時間、峰面積見表3。

圖4 貫筋藤多糖水解物色譜圖Fig.4 Chromatogram of polysaccharide hydrolysate from Dregea sinensis Hemsl.

表3 貫筋藤多糖色譜信息Table 3 The information of chromatography in polysaccharide of Dregea sinensis Hemsl.

7個單糖標準品的順序為鼠李糖：11.339 min；巖藻糖：12.509 min；阿拉伯糖：14.569 min；木糖：15.000 min；甘露糖：15.498 min；葡萄糖：16.815 min；半乳糖：19.998 min。通過與單糖標準品保留時間和離子碎片確定貫筋藤多糖由巖藻糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成，果糖未檢出，其中葡萄糖和半乳糖摩爾百分含量達到90%以上，說明貫筋藤多糖主要是由葡萄糖和半乳糖組成，由表3可知，其百分含量分別為葡萄糖80.3 %、半乳糖11.7 %、甘露糖3.98 %、阿拉伯糖3.69%、巖藻糖0.349%。

4 討論

采用水提醇沉法提取多糖存在一個缺陷，部分分子量較小的多糖會保留在上清中，而使多糖的測定結果偏低。多糖的提取方法還有酸提法、堿提法、超聲輔助法、凍融輔助法等[24]，低溫低壓提取、增壓提取及超臨界流體萃取法[25]。孫曉雪等[26]對比了傳統的Sevag法，三氯乙酸法和胰蛋白酶法脫蛋白對多糖損失率的影響，得出酶法的脫蛋白率最高和多糖損失率最低，在忽略成本的條件下，利于多糖后續的分離純化，其中多糖中蛋白質的含量可采用考馬斯亮藍染色法。除單糖組成外，官能團的差異、分子量的大小均能影響多糖的生理活性，對單糖進行進一步分離純化后研究其構效關系，可采用紅外光譜，通過檢測特征峰、峰寬、峰距離推測分子內和分子間的氫鍵、糖苷鍵、官能團的情況，掃描電鏡、原子力顯微鏡等表征待測多糖結構，并結合體外體內抗氧化、降血脂、降血糖等活性[27]。董竹平等[28]認為多糖的三螺旋螺旋結構與其生理活性有關。Maeda 等[29]發現具有三螺旋結構的 β-（1，3）葡聚糖比不具有三螺旋結構的該葡聚糖具有更強的抗腫瘤和免疫調節作用。

5 結論

貫筋藤多糖脫色后呈灰白色粗粉狀，微甜澀味，具有植物清香和焦糖味，屬于非淀粉性多糖，由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、巖藻糖5種單糖組成，葡萄糖和半乳糖是貫筋藤多糖的主要成分，多糖提取工藝為料液比為1∶25（g/mL），浸提溫度75℃，浸提時間60 min，多糖得率7.04%，總糖含量為16.7%。研究為貫筋藤植物的開發及綜合高效利用提供科學依據。