植物乳桿菌對獼猴桃果酒品質影響的評價

葛東穎，李華佳，劉雪婷，楊成聰，陳欣蕾，郭壯，*

（1.湖北文理學院 食品科學技術學院 鄂西北傳統發酵食品研究所，湖北 襄陽 441053；2.四川省農業科學院 農產品加工研究所，四川 成都 610066）

作為呼吸躍變型水果，獼猴桃采摘后不易保藏和運輸，長時間貯藏易變軟和腐敗變質，因此對其進行深加工則顯得尤為重要[1]。獼猴桃果酒作為獼猴桃深加工的產品，不僅具有濃郁醇厚的酒香，其VC的含量也相對較高，具有較好的保健作用[2]。但目前獼猴桃果酒的市場接受度卻并不高，究其原因在于獼猴桃果酒的酸度過高，消費者難以接受[3]。多年來，國內外的眾多研究者都致力于借助蘋果酸-乳酸發酵（malolactic fermentation，MLF）來降低果酒中的酸度[4]。

在MLF 發酵過程中，酒類酒球菌（Oenococcus oeni）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）可以把口感尖銳的蘋果酸轉化為口感圓潤的乳酸，從而實現了果酒酸度的降低[5]。然而目前商業化的O.oeni 生長緩慢且對于環境及營養的要求較高，生長周期較長，延緩了工業化生產周期，增加了污染的潛在可能性[6]，L.plantarum 對環境的適應能力較強、生產速度快，使獼猴桃果酒的產業化生產成為了可能[7]。電子舌和電子鼻技術在食品品質的評價方面具有廣泛的應用，不僅可以快速的對食品滋味和風味品質進行分析，而且具有不受主觀因素影響的優點[8]，兩種技術相結合目前在紅酒[9-10]、橄欖油[11]、櫻桃番茄汁[12]和魚肉[13]的品質評價中有著廣泛的應用。

本研究以鄂西北傳統發酵食品菌種資源庫中39株L.plantarum（植物乳桿菌）為依托，將其與酵母菌混合發酵進行獼猴桃果酒制備，并使用電子舌和電子鼻相結合的手段對獼猴桃果酒的品質進行評價，同時結合高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）技術對果酒中有機酸構成進行了分析，以期從中篩選出發酵性能優良的菌株用于后續獼猴桃果酒的生產。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

徐香獼猴桃：市售；39 株L.plantarum（植物乳桿菌）：由湖北文理學院鄂西北傳統發酵食品菌種資源庫提供，其中1號～5號菌株編號為HBUAS52005、HBUAS52006、HBUAS52007、HBUAS52008 和 HBUAS52010，6～10號菌株編號為 HBUAS52015、HBUAS-52016、HBUAS52017、HBUAS52018 和 HBUAS52019，11號～15號菌株編號為 HBUAS52020、HBUAS52154、HBUAS52168、HBUAS52173和HBUAS52175，16號～20號菌株編號為 HBUAS52151、HBUAS52153、HBUAS52155、HBUAS52166 和 HBUAS52158，21號～25號菌株編號為HBUAS52340、HBUAS52336、HBUAS52337、HBUAS5 -2343 和 HBUAS52345，26號～30號菌株編號為HBUAS-52346、HBUAS52350、HBUAS52333、HBUAS5232 1 和HBUAS52323，31號～35號菌株編號為 HBUAS52324、HBUAS52328、HBUAS52352、HBUAS52339 和HBUAS-52322，36號～39號菌株編號為 HBUAS52325、HBUAS-52327、HBUAS52354 和 HBUAS52356；RW 葡萄酒·果酒專用酵母：安琪酵母股份有限公司；甲醇（色譜純）、異丙醇（色譜純）、磷酸二氫鉀（優級純）、奎寧酸（優級純）、蘋果酸（優級純）、乳酸（優級純）、檸檬酸（優級純）：國藥集團化學試劑有限公司；氯化鈉：分析純，天津市化學試劑研究所有限公司；國藥集團化學試劑有限公司；果膠酶（5 萬 U/g）、偏重亞硫酸鉀：食品級，煙臺帝伯仕自釀機有限公司；參比溶液、陽離子溶液、預處理溶液、陰離子溶液、內部溶液：日本INSENT 公司。

SA 402B 電子舌（配備2個參比電極和5個味覺傳感器）：日本 Insent 公司；PEN3 電子鼻（配備 10個金屬傳感器）：德國Airsense 公司；LC-20ADXR 高效液相色譜儀、InertSustainSwift C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、SPD-M20A 二極管陣列檢測器：日本島津公司；CR21N 高速離心機：日本日立公司；250B 數顯生化培養箱：金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 獼猴桃果酒的制作

選擇相同成熟度且無變質的獼猴桃去皮后破碎入罐，按添加0.10 mg/L 偏重亞硫酸鉀和0.06%的果膠酶，攪拌均勻后使用白砂糖調節糖度至22°Brix，接種酵母6 h 后分裝為40 罐，按照106CFU/mL 獼猴桃酒添加量分別接入 39 株 L.plantarum 于 22℃發酵 7 d 后18℃后發酵20 d，樣品5 000 r/min 離心10 min 取上清液待用[14]。設置不添加L.plantarum 的樣品為對照組。

1.2.2 基于電子舌獼猴桃果酒的滋味品質評價

參考王玉榮等[15]和郭壯等[16]對米酒滋味品質測定的條件并做適當優化。取40 mL 果酒樣品和80 mL 蒸餾水混合均勻后10 000 r/min 離心10 min，取上清液抽濾待用。每個樣品重復測定4 次，取后3 次數據為試驗數據。

1.2.3 基于電子鼻獼猴桃果酒的風味品質評價

參考張振等[17]和徐晚秀等[18]對黃酒和白酒風味品質測定的條件并做適當優化。取10 mL 果酒樣品于電子鼻樣品瓶中，50℃保溫30 min，室溫靜置10 min 后插入電子鼻探頭進行測定，平行測定3 次。響應曲線在 60 s 后達到穩定，選取 69、70 s 和 71 s 的響應值，并計算其平均值為測試值。

1.2.4 基于HPLC 獼猴桃果酒中有機酸測定

參考王剛等[19]和楊成聰等[20]對獼猴桃果酒和米酒有機酸測定的條件并做適當優化，對獼猴桃果酒中奎寧酸、乳酸、蘋果酸和檸檬酸的含量進行測定。準確吸取2 mL 果酒樣品于10 mL 容量瓶中，加入0.2 mL 的0.1 mol/L 的磷酸溶液后用流動相定容，過0.22 μm 針孔濾膜待用。參數設置：流動相為0.01 mol/L 磷酸二氫鉀溶液（pH 2.50），柱溫 30℃，流速 1.0 mL/min，檢測器為二極管陣列紫外-可見光檢測器，檢測波長215 nm。采用保留時間對果酒中4種有機酸進行定性，采用峰面積和外標法對4種有機酸進行定量計算。

1.2.5 統計學分析

使用主成分分析法（principal component analysis，PCA）和多元方差分析（multivariate analysis of variance，MANOVA）對獼猴桃果酒品質進行分析，采用Mann-Whitney 檢驗對不同分組獼猴桃果酒各指標的差異性進行分析。采用PAST 3 軟件做PCA，其他分析均使用MATLAB 2016b 軟件；使用 Origin 2017 繪圖。

2 結果與分析

2.1 獼猴桃果酒滋味和風味品質評價

本研究首先使用電子舌技術對獼猴桃果酒8個滋味品質指標進行了測定，結果如圖1所示。

圖1 獼猴桃果酒各滋味指標的箱形圖（n=40）Fig.1 Box diagram of the taste indicators of kiwi fruit wine（n=40）

由圖1可知，納入研究的40個獼猴桃果酒在酸味和后味B（苦的回味）上具有較大的組間差異，極差值分別為5.05 和3.55，其次為苦味、咸味、豐度（鮮味的回味）和后味A（澀味的回味），極差值分別為2.69、2.22、1.63 和1.06，而在鮮味和澀味上的差異值較小，分別為0.99 和0.89。當不同樣品在某一滋味指標上的差值大于1.0 時，其差異可以通過感官鑒評的方法予以區分出[21]，由此可見，獼猴桃果酒的鮮味和澀味不會影響消費者對產品的喜好程度。

由圖1 亦可知，添加L.plantarum 發酵后部分獼猴桃果酒較之對照組其酸味、苦味、澀味、咸味和后味A（澀味的回味）呈明顯下降趨勢，而部分獼猴桃果酒的豐度（鮮味的回味）呈現上升趨勢。由此可見，添加L.plantarum可明顯改善獼猴桃果酒的滋味品質，然而這與菌株自身的發酵特性有關，不同菌株之間差異較大，因而進行獼猴桃果酒用優良MLF 植物乳桿菌的篩選則顯得尤為重要。本研究進一步采用電子鼻技術對不同處理獼猴桃果酒中典型物質類型進行了測定，結果如表1所示。

表1 獼猴桃果酒中風味指標的差異性分析（n=40）Table 1 Difference analysis of flavor indicators in kiwi fruit wine（n=40）

由表1可知，傳感器 W1C、W6S、W1S、W1W 和W3S 對添加L.plantarum 發酵獼猴桃果酒的響應值明顯偏低，而傳感器W5S 和W5C 呈現出相反的趨勢。由此可見，添加L.plantarum可明顯提升獼猴桃果酒的香氣成分，同時對部分不良氣味具有明顯的降低作用。

2.2 基于PCA獼猴桃果酒的差異性分析

以滋味和氣味為評價指標，在構建18 行×40 列矩陣的基礎上，本研究使用PCA 對獼猴桃果酒品質的區分度進行了評價，PCA 的方差貢獻率如表2所示。

表2 主成分的方差貢獻率Table 2 Variance contribution rate of principal components

由表2可知，僅PC1 的特征值大于1，前5個主成分的累計方差貢獻率為87.89 %，分別為41.93 %、23.81%、13.27%、4.77%和4.11%。由此可知，18個評價指標降為了5個不相關的綜合變量，說明了這5個綜合變量代表了絕大部分的變量信息，達到了降維的目的。基于PCA 獼猴桃果酒因子載荷圖如圖2所示。

圖2 基于PCA 獼猴桃果酒品質的因子載荷圖Fig.2 Factor load map based on PCA kiwi fruit wine quality

由圖2可知，第一主成分（PC1）主要是由W3C、W2S、W1S、W2W、W1W 和 W3S 6個指標構成，PC1中載荷量較高的正影響品質評價指標是W3S、W1S、W1W、W2W、W2S 和 W6S，其中 W3S 的載荷量最高為0.34，載荷量較高的負影響品質評價指標是W3C，其載荷量為0.32，即PC1 的差異性主要集中在烷烴類物質和芳香類物質上；第二主成分主要是由W5C、澀味、W5S、后味A（澀味的回味）、酸味和W1C 構成并占全部權重的23.81%，PC2中載荷量較高的正影響品質評價指標是W5C、澀味、后味A（澀味的回味）和酸味，其中W5C 的載荷量最高為0.40，載荷量較高的負影響品質評價指標為W1C，其載荷量為0.33，即PC2 的的差異性主要集中在澀味和芳香類物質上。基于PCA 分析獼猴桃果酒的因子得分圖如圖3所示。

圖3 基于PCA 獼猴桃果酒品質的因子得分圖Fig.3 Factor score map based on PCA kiwi fruit wine quality

由圖3可知，40個獼猴桃果酒樣品在4個象限均有分布，其中分布于第一、二、三和四象限的樣品數分別為8、14、10個和8個。結合因子載荷圖可知，偏向X 軸正方向的獼猴桃果酒樣品在烷烴類、甲烷類、有機硫化物和乙醇的相對含量較高，偏向X 軸負方向的獼猴桃果酒樣品在芳香類物質含量較高；而偏向Y 軸正方向的獼猴桃果酒樣品在澀味、酸味、后味A（澀味的回味）和氫氧化物等強度較大，偏向Y 軸負方向的獼猴桃果酒樣品的芳香類物質含量較高。由此可知，位于第三象限的獼猴桃果酒品質最好，其次為第二、第四和第一象限，因而第三象限的10 株菌株，尤其是7號（菌種資源庫中編號為 HBUAS52016）和8號L.plantarum（菌種資源庫中編號為HBUAS52017）可以作為獼猴桃果酒用優良MLF 植物乳桿菌的潛在菌株進行后續篩選。

2.3 獼猴桃果酒有機酸的分析

本研究以PCA 結果為分組依據，將40個獼猴桃果酒樣品分為 A、B、C組和 D組，同時結合 HPLC 對獼猴桃果酒中的4種有機酸進行分析，從而對造成不同品質獼猴桃果酒間差異的關鍵物質進行甄別，進而為后續獼猴桃果酒用L.plantarum 的篩選提供指導。不同分組獼猴桃果酒中有機酸含量的比較分析結果如表3所示。

表3 獼猴桃果酒中4種有機酸的差異性分析Table 3 Difference analysis of four organic acids in kiwi fruit wine

由表3可知，獼猴桃果酒中奎尼酸的含量最高、其次是檸檬酸、乳酸和蘋果酸。經Mann-Whitney 檢驗發現，C組獼猴桃果酒中奎尼酸和檸檬酸的含量顯著低于其他組（P〈0.05），而蘋果酸和乳酸的含量與其他組顯著均不差異（P〉0.05）。由此可見，品質較佳的獼猴桃果酒其有機酸含量偏低，且添加L.plantarum可明顯降低獼猴桃果酒中的有機酸含量。

3 結論

以鄂西北傳統發酵食品菌種資源庫中39 株L.plantarum 為依托，將其與酵母菌混合發酵進行獼猴桃果酒制備，并使用電子舌和電子鼻相結合的手段對獼猴桃果酒的品質進行了評價，結果發現部分L.plantarum 通過降低獼猴桃果酒的酸味、苦味和澀味及提升香氣成分從而改善了獼猴桃果酒的品質，且L.plantarum HBUAS52016 和L.plantarum HBUAS52017可作為獼猴桃果酒用優良MLF 植物乳桿菌的潛在菌株進行后續篩選。