螯合劑輔助乙醇提取獼猴桃皮黃酮的工藝優化

伊莉，趙處敏，馮翠萍，王曉聞，吳鎖柱，延莎

（山西農業大學 食品科學與工程學院，山西 晉中 030801）

獼猴桃是我國種植量非常大的一種水果，大多數的省份都有種植。獼猴桃廣受喜愛，很重要的一個原因就是其果實中含有大量的抗衰老物質，可以有效的清除人體內的自由基[1-3]。除此之外，獼猴桃皮中也含有黃酮等功能活性物質，可以加以利用。但大多數企業為了追求效益，也限制于生產加工工藝和技術的落后，大多將獼猴桃皮丟棄，或加工成動物飼料，造成了極大的浪費。

黃酮類物質為存在于自然界中對人體有諸多益處的一類植物源化合物，多見于果蔬、茶、葡萄酒等食品中，黃酮類化合物越來越成為了藥理學和營養保健食品學的研究重點，它所具有的抗癌，抗氧化等作用已經在科學研究中發揮出巨大的作用，特別是在心腦血管方面，增加類黃酮攝入，可以降低患冠狀動脈心臟病的危險[4-7]。對于植物資源中黃酮類物質的提取，常用的有熱水提取法和醇提法，熱水浸提法雖然成本低，但是用時較長；醇提法是分離黃酮類物質最常用的方法，提取效率高，操作簡便[8-12]。獼猴桃皮中含有大量的鈣、鐵等微量元素，這些礦物質元素易與有機大分子物質螯合降低提取率。在提取同時加入螯合劑，可以與金屬離子絡合為金屬絡合物，通過競爭金屬離子游離出有機大分子[13-15]。本試驗采用螯合劑六偏磷酸鈉輔助乙醇溶劑浸提獼猴桃皮中的黃酮類物質，對提取工藝進行優化，確定提取獼猴桃皮中黃酮類物質的最佳工藝條件，為提升獼猴桃皮的附加值提供一定的理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

獼猴桃：市售；無水乙醇，硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、六偏磷酸鈉等均為分析純：國藥集團化學試劑公司；蘆丁標準品（UV≥98%）：上海圻明生物科技有限公司。

1.2 儀器和設備

101-2 型電熱恒溫鼓風干制箱：上海精宏實驗設備有限公司；UV-1200 型紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；JY-15A 型多功能粉碎機：江業制造有限公司；HH4 型恒溫水浴鍋：常州澳華試驗設備公司；TD5G 臺式低速離心機：鹽城市凱特實驗儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料預處理

精選七到八分熟的新鮮獼猴桃，洗凈，取果皮切成1 cm×1 cm 的小塊，放入60℃鼓風干燥箱內，待干燥后進行粉碎，過60 目篩，得到獼猴桃皮粉末備用。

1.3.2 黃酮得率的計算

采用 NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 光度法檢測黃酮含量，用蘆丁標準品參考文獻[3]的方法繪制標準曲線。獼猴桃皮黃酮的得率按式（1）計算。

式中：X 為依據標準曲線計算所得的黃酮含量，mg/g；N 為獼猴桃皮粉原液稀釋倍數，V 為原液體積，mL；M 為樣品質量，g。

1.3.3 單因素試驗

精確稱取獼猴桃皮粉5 g，按照不同的料液比加入一定濃度的乙醇溶劑，同時按照不同比例加入螯合劑六偏磷酸鈉，置于不同溫度的恒溫水浴中提取一定時間，3 600 r/min 條件下離心10 min，取上清液。重復提取2 次，合并上清液。在波長505 nm 處比色，根據1.3.2 的方法計算黃酮得率。各水平的選擇詳見表1。

1.3.4 正交試驗

在單因素試驗結束后，通過對結果的分析，從5個因素中選擇4個對獼猴桃皮黃酮得率影響較大的因素，進行正交試驗，確定最優工藝。

表1 單因素試驗水平選擇Table 1 Factors and levels used in single-factor tests

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

試驗得到蘆丁標準曲線見圖1。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Rutin standard curve

由圖1可知，標準曲線回歸方程為y=12.228x+0.004 8，R2=0.999 7，線性關系良好。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 料液比的單因素試驗結果

料液比的單因素試驗結果如圖2所示。

圖2 料液比對提取效果的影響Fig.2 The effect of liquid-solid ratio on flavonoids extraction ratio

從圖2中可觀察到，當料液比為 1∶20（g/mL）時，黃酮得率最高，達到1.032%。料液比在1∶20（g/mL）～1∶30（g/mL）范圍內時，獼猴桃皮黃酮的得率并沒有隨之增大。綜合考慮成本因素，選取1∶20（g/mL）為最適合的料液比。

2.2.2 提取時間的單因素試驗結果

提取時間的單因素試驗結果如圖3所示。

圖3 提取時間對提取效果的影響Fig.3 The effect of time on flavonoids extraction ratio

從圖3中可觀察到，提取時間越長，黃酮得率也在逐漸升高，當提取時間達到70 min 時達到最高，此時黃酮得率為1.161%。隨著提取時間繼續延長，獼猴桃皮黃酮的得率基本保持不變。因此，選取最適合的提取時間為70 min。

2.2.3 提取溫度對黃酮得率的影響

提取溫度對獼猴桃皮黃酮得率的影響結果如圖4所示。

圖4 提取溫度對提取效果的影響Fig.4 The effect of temperature on flavonoids extraction ratio

由圖可知，在50℃～80℃范圍內，提高提取溫度，黃酮得率逐漸提高。當達到80℃時，得率達到最高，為1.341%。當溫度高于80℃以上繼續升高時，黃酮得率不但沒有升高，反而有所下降?？赡艿脑蚴歉邷貙е曼S酮物質的結構破壞而影響了提取效果，因此選取最合適的溫度為80℃。

2.2.4 乙醇濃度的單因素試驗結果

乙醇濃度的單因素試驗結果如圖5所示。

由圖5 分析可得，乙醇濃度越高，得率逐漸提高。當乙醇濃度達到70%時，得率達到最高，為1.356%。在高于70%時，提高乙醇濃度，獼猴桃皮黃酮的得率并沒有繼續升高，反而略有下降?？赡艿脑驗橛捎谔崛∫褐谐S酮外的其他物質隨著乙醇濃度的升高，溶解度升高，提取量也隨之加大，阻礙了黃酮的提取。因此選取最合適的乙醇濃度為70%。

圖5 乙醇濃度對提取效果的影響Fig.5 The effect of ethanol concentration on flavonoids extraction ratio

2.2.5 螯合劑六偏磷酸鈉添加量的單因素試驗結果

螯合劑六偏磷酸鈉的添加量的單因素試驗結果如圖6所示。

圖6 螯合劑添加量對提取效果的影響Fig.6 The effect of chelating agent on flavonoids extraction ratio

從圖6中可以看出，在一定范圍內，六偏磷酸鈉添加量越高，獼猴桃皮黃酮的得率逐漸升高。當螯合劑的添加量達到0.5%時，獼猴桃皮黃酮的得率最高，為1.485%。當螯合劑添加量高于0.5%時，隨著螯合劑添加量的提高，獼猴桃皮黃酮的得率不但沒有提高，反而有所下降，可能是因為隨著螯合劑添加量的增加，與樣液中的水分相結合，使樣液的極性在提取時發生變化，最后造成了提取效果不明顯，降低了黃酮的提取量。因此選取最合適的螯合劑添加量為0.5%。

2.3 正交試驗結果

在單因素試驗結果基礎上，選取對獼猴桃皮黃酮得率影響較大的提取時間、提取溫度、乙醇濃度、螯合劑（-SH）六偏磷酸鈉添加量等4個因素，進行四因素三水平的正交試驗，優化螯合劑輔助乙醇浸提獼猴桃皮中黃酮的工藝參數，選擇料液比1∶20（g/mL），因素水平表見表2。

正交試驗結果如表3所示。

結果表明，在試驗4中獼猴桃皮中黃酮的得率最高，即A2B1C2D3，此時的獼猴桃皮黃酮得率為1.518%。從極值大小可以看出4種因素對試驗結果影響的效果為C（提取時間）〉A（提取溫度）〉B（乙醇濃度）〉D（螯合劑六偏磷酸鈉添加量）。對正交試驗結果分析可知，最優水平組合為A2B1C2D3，與通過正交試驗結果表中最優水平組合試驗4 相同，所以最優工藝參數提取時間70 min，提取溫度80℃，乙醇濃度60%，螯合劑六偏磷酸鈉添加量0.6%。此時獼猴桃皮中黃酮的得率為1.518%。

表2 正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of the orthogonal experimental design

表3 正交試驗優化結果Table 3 The results of orthogonal experiment

3 結論與討論

在獼猴桃皮黃酮提取的試驗中，結果顯示添加含巰基（-SH）的螯合劑六偏磷酸鈉，可以明顯的提高黃酮的提取效果。通過單因素試驗和正交試驗，最終確定獼猴桃皮中黃酮的最佳提取條件為：料液比1∶20（g/mL），提取時間 70 min，提取溫度 80℃，乙醇濃度60%，螯合劑六偏磷酸鈉添加量0.6%。此時黃酮得率達到1.518%。

含巰基（-SH）的螯合劑選擇了六偏磷酸鈉，食品級六偏磷酸鈉應用在多種食品中，如腌制肉、水果飲料、冰激凌和乳制品等。由于在提取黃酮時，螯合劑的使用量很小，在安全用量范圍內，因此可以利用六偏磷酸鈉輔助提取黃酮，為今后獼猴桃皮的綜合利用提供理論依據。