大豆根瘤內生菌全細胞可溶性蛋白SDS-PAGE電泳圖譜分析

徐亞軍，李珂，劉珂珂，袁圓圓，孫笑顏，趙龍飛，2，*

（1.商丘師范學院 生物與食品學院，河南 商丘 476000；2.河南省特色微生物資源開發與應用工程研究中心，河南 商丘 476000）

植物內生菌是指生活在特定階段能與植物形成互利關系的微生物，種類繁多、分布廣泛[1]。大多數內生菌產生的活性物質對植物生長有益，成為植物微生態系統中的重要組成部分[2]。由于植物內生菌具有促進宿主氮代謝[3]、修復重金屬污染[4]、抑制病原菌生長[5]、促進植物生長等多種功能[6-7]。因此，對植物內生菌的研究成為國內外微生物資源研究的焦點[8-11]，但目前對豆科植物根瘤內生菌的研究相對較少。對內生細菌分類研究一般采用形態學、生理生化特性和16S rDNA測序方法，但對于某些菌株，該方法只能初步確定其類別且工作量較大[12]。基于此，本文以大豆根瘤內生菌為試驗材料，對其進行全細胞可溶性蛋白質十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE） 圖譜分析，以期獲得分析根瘤內生菌系統發育地位的一種有效輔助手段。

SDS-PAGE 是檢測蛋白質相對分子質量的常用試驗技術，受到廣泛關注[13]。聚丙烯酰胺凝膠是一種透明而不溶于水并有韌性的凝膠，由N，N-亞甲叉雙丙烯酰胺和丙烯酰胺組成[13-14]。由于聚丙烯酰胺凝膠電泳具有精細度高、分子交聯度高、分辨率強、分離范圍窄、可分離相差較小的蛋白質樣品等優點，故在蛋白質相對分子質量測定中占有極其重要地位[14]。通過與標準蛋白質樣品的相對遷移率對比，可估計待測蛋白質樣品的相對分子質量[15]。SDS-PAGE 主要用于提純過程中純度的檢測、藥物檢測、食品等方面，單個亞基組成的蛋白質通常只有一條帶，但若蛋白質是由2個或2個以上的亞基組成的，則會出現多個條帶[16]。由于不同分子量的蛋白質電泳速度不同，在經過分離膠時會形成不同遷移率的條帶，根據標準蛋白質相對遷移率估計待測蛋白質的相對分子質量[17]。本文以大豆根瘤內生菌為試驗材料，采用5%分離膠，對其進行全細胞可溶性蛋白質SDS-PAGE 圖譜分析，比較大豆根瘤內生菌蛋白質電泳條帶圖譜間的聯系和區別，確定根瘤內生菌16S rDNA 分子鑒定結果間的對應性[18]，探索SDSPAGE 在內生菌鑒定過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗菌株：大豆根瘤內生菌 7、21、44、52、53、70、72、123、125、132、161、166、170、210、254 是課題組（U1204301“大豆根瘤內生菌對小麥的促生作用機理研究”）分離、純化和保藏。

十二烷基硫酸鈉、聚丙烯酰胺：北京索萊寶科技有限公司；過硫酸銨、溴酚藍、考馬斯亮藍G250：北京奧博星生物技術有限責任公司；蛋白質marker：上海翊圣生物科技有限公司；甘氨酸、酵母膏、胰蛋白胨、三羥甲基氨基甲烷：上海藍季科技發展有限公司。

1.2 儀器與設備

PV-30/70 超凈工作臺：西班牙泰事達公司；MLS-375 高壓滅菌鍋：日本三洋電氣有限公司；Anke TDL-5-A 離心機：上海安亭科學儀器廠；QT-2 智能漩渦混合器：上海琪特分析儀器有限公司；ZHP-100 恒溫震蕩培養箱：上海三發科學儀器有限公司；HP1000GC 智能人工氣候箱：武漢瑞華儀器設備有限責任公司；pHs-3E pH 計：上海儀電科學儀器股份有限公司；JY600 電泳儀：北京君意東方電泳設備有限公司等。

1.3 試驗方法

1.3.1 分離膠制備和溶液配制

10%濃度分離膠制備：重蒸水4.0 mL，30%聚丙烯酰胺2.6 mL，三羥甲基氨基甲烷-鹽酸[tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris-HCl]2.6 mL，10 %過硫酸銨 100 μL，10%SDS 100 μL，四甲基乙二胺（N，N，N'，N'-Tetramethylethylenediamine，TEMED）6 μL。

5%濃度分離膠制備：ddH2O 3.4 mL，30 %聚丙烯酰胺 0.83 mL，Tris-HCl 0.68 mL，10%過硫酸銨 50 μL，10%SDS 53 μL，TEMED 5 μL。

2×上樣緩沖液：甘油2.0 mL，0.5 mol/L Tris-HCl（pH6.8）2.5 mL，β-巰基乙醇 1.0 mL，質量濃度為10%的 SDS 4.0 mL，0.1%的溴酚藍1.5 mL，總體積 10 mL（4℃冰箱保存）。

電極緩沖液（pH 8.3）：取甘氨酸 14.4 g，SDS 1.0 g，Tris 3.0 g，加重蒸水至 1 000 mL（4℃冰箱保存）。

考馬斯亮藍染色液：取91 mL 50%甲醇，0.25 g 考馬斯亮藍G-250，9 mL 冰乙酸混勻（4℃冰箱保存）。

脫色液：取 50 mL 甲醇、75 mL 冰乙酸，定容至1 000 mL（4℃冰箱保存）。

TE 緩沖液：取0.001 mol/L 乙二胺四乙酸（ethylenediaminete traacetic acid，EDTA）0.03 g，0.01 mol/L Tris 0.12 g，用冰乙酸調 pH 值至 8.0，定容至 1 000 mL（4℃冰箱保存）。

LB 培養基的配制（1 000 mL）：酵母膏 30 g、NaCl 3 g、胰蛋白胨 10 g。

1.3.2 菌體培養

將待測菌株接種在LB 培養基中，置于恒溫培養箱中220 r/min 28℃震蕩培養2 d，定期查看菌株生長狀況并記錄其長勢。

1.3.3 蛋白質樣品的處理

用1 mL 移液槍抽取1 mL 菌懸液至1.5 mL 離心管中，在高速冷凍離心機2 000 r/min 離心2 min，棄上清，每管重復5 次，每株菌可設置3 管～5 管平行對照，以備用。

向離心過的管中加入50 μL 三羥甲基氨基甲烷+乙二胺四乙酸緩沖液及等量2×上樣緩沖液，密封后水浴煮沸10 min。

將煮好的蛋白質置于高速冷凍離心機10 000 r/min離心1 min，取上清進行SDS-PAGE。

1.3.4 蛋白質Marker 的處理

向已分裝好的標準蛋白樣品中加入10 μL 樣品緩沖液，充分混勻后煮沸5 min。

1.3.5 制膠及電泳

稱取適量分離膠藥品并混勻，小心加至膠板間隙中，在距玻璃板頂部2 cm 處停止灌膠，立刻在分離膠上加上一層無水乙醇。待完全聚合后，倒掉覆蓋層，用無菌水沖洗凝膠頂部數次并用濾紙吸干水分。按上述5%濃縮膠的配方稱取適量藥品后充分混勻并緩慢灌膠，待聚合完成后拔掉梳子，用無菌水沖洗加樣孔以除去未聚合的丙烯酰胺，弄直膠齒，用事先剪好的濾紙條小心吸干加樣孔中的水分。抽掉絕緣條，將凝膠板固定在電泳裝置上并倒入電泳緩沖液使其覆蓋住加樣孔。第一個孔點上標準蛋白質樣品，其它孔按順序加樣，每孔上樣量約為 5 μL～10 μL。先用 80 V 電壓電泳，當藍色條帶遷移至濃縮膠與分離膠分界線時，換用110 V 電壓，當藍色條帶遷移到分離膠底部時停止電泳。

1.3.6 染色、脫色及保存

電泳完成后，關閉電源，取下玻璃板，將膠板小心滑入盛有考馬斯亮藍G-250 染液中染色40 min 后，用脫色液脫色至條帶清晰、背景無色為止，拍照并將膠保存在20%的甘油中。

1.3.7 內生細菌16S rDNA 測序及比對

采用十六烷基三甲基溴化銨法提取內生菌基因組DNA，以基因組DNA 為模板，進行16S rDNA 擴增、測序，所用引物、擴僧體系、反應條件見參考文獻[18]。根據測序所得序列在GenBank中進行基本局部序列比對（basic local alignment search tool，BLAST）。

2 結果與分析

2.1 單次點樣的SDS-PAGE圖譜比較

菌株的單次點樣SDS-PAGE 圖譜見圖1。

圖1 菌株的單次點樣SDS-PAGE 圖譜Fig.1 Electrophoretogram of SDS-PAGE tested strains with single point

由圖1可知，測試菌株均具有多條帶，由多個蛋白質亞基組成。不同菌株電泳后所得條帶相似程度不同。菌株70 與72 的蛋白質白圖譜有近似條帶，但在35 kD～135 kD 間蛋白質條帶差異較大。

試驗菌株的16S rDNA 測序比對結果見表1。

根據16S rDNA 測序比對結果（表1），兩者最相似屬種分別為Ochrobactrum intermedium、Bacillus tequi－lensis/subtilis，說明兩者之間在屬水平上存在差異。72和210 的蛋白質圖譜及其相似，16S rDNA 測序比對結果表明，二者最相似菌株均為Bacillus tequilensis/subtilis。其他幾株菌的電泳圖譜存在較大差異，16S rDNA測序顯示，菌株 44、52、161、166、170、254 的最相似屬種分別為 Bacillus horikoshii、Sinorhizobium fredii、Acinetobacter calcoaceticus、Pseudomonas geniculate、Stenotrophomonas sp、Enterobacter ludwigii，可見菌株彼此間親緣關系較遠，蛋白質電泳結果與16S rDNA 測序結果一致，說明大豆根瘤內生菌電泳圖譜與16S rDNA 分子鑒定結果間具有一定的對應性。因此，SDS-PAGE 在對內生菌輔助鑒定過程中是一種有效的方法與手段。

表1 測試菌株16S rDNA 測序比對結果Table 1 The 16S rDNA sequences alignment results of tested strains

2.2 重復點樣的SDS-PAGE電泳圖譜比較

內生菌 7、21、53 的的 3 次點樣 SDS-PAGE 電泳圖譜見圖2。

圖2 內生菌7、21、53 的SDS-PAGE 電泳圖譜3 次點樣比較（M：蛋白質標記）Fig.2 Electrophoretogram of SDS-PAGE tested strains 7，21，53 with three repeats（M：protein marker）

從圖2可知，每個測試菌株均有多個條帶，菌株圖譜條帶間存在較大的差異。同一株菌3 次平行點樣的蛋白質圖譜完全一致，說明重復點樣不影響蛋白質亞基的分子量。經16S rDNA 測序比對表明，重復點樣后同一株菌的最相似屬種不變，說明根據條帶判斷親緣關系是可靠的。電泳結果顯示，與菌株7 與53 相比，菌株21 圖譜條帶較多且密，說明菌株21 與菌株7 和53親緣關系較遠。菌株7 與53 的蛋白質電泳條帶相似度較高，而16S rDNA 測序結果表明，菌株7 與53 最相似屬種均為Bacillus subtilis，最相似菌株均為HRA69 且相似度均為100%，這充分說明菌株7 與53 為同一株菌，而菌株21 最相似屬種為Enterobacter ludwigii，與7和53 在屬種進化關系較遠。蛋白質電泳圖譜結果與16S rDNA 序列比對結果一致，再次說明SDS-PAGE 在對內生菌輔助鑒定過程中是一種有效的方法和手段。

內生菌 123、125、132 的 SDS-PAGE 電泳圖譜 3次點樣圖譜見圖3。

圖3 內生菌 123、125、132 的 SDS-PAGE 電泳圖譜 3 次點樣（M：蛋白標記）Fig.3 SDS-PAGE electrophoresis of endophytic bacteria 123，125，132 with three repeats（M：protein marker）

從圖3可知，上述3 株菌均有多個蛋白質條帶，均含有多個蛋白質亞基。同一株菌3 次重復點樣的蛋白質亞基相對遷移率幾乎完全一致，重復點樣不影響蛋白質亞基的分子量。經16S rDNA 測序比對分析，重復點樣同一株菌的最相似屬種不變，重復點樣進行點樣不影響親緣關系。電泳結果顯示，3 株菌在凝膠底部的圖譜一致且顏色深淺無差異，說明三者的蛋白質含量及分子量均接近。菌株123 與132 的蛋白質圖譜有相似之處，但菌株125 蛋白質圖譜與123 和132 差別較大，說明彼此間親緣關系遠。16S rDNA 比對結果顯示，123 最相似屬種為Bacillus cereus、132 最相似屬種為Bacillus aryabhattai、125 最相似屬種為 Bacillus cereus，說明123 與125 親緣關系較近，與132 親緣關系稍遠。上述結果說明僅僅根據蛋白質電泳圖譜只能大致鑒定內生菌的親緣關系，若需準確鑒定，還需經過16S rDNA 測序。

2.3 同一株菌上樣量不同的SDS-PAGE圖譜分析

菌株 7、21、53 不同上樣量的 SDS-PAGE 圖譜見圖4。

圖4 菌株7、21、53 不同上樣量的SDS-PAGE 圖譜（M：蛋白標記）Fig.4 SDS-PAGE profiles of different sample volume strain 7，21，53（M：protein marker）

從圖4可知，上樣量為 7 μL 和 14 μL 時電泳后蛋白質條帶蛋白質亞基的相對遷移率沒有變化，只是后者顏色較深，這說明蛋白質分子量不隨點樣量的變化而變化，但蛋白質含量與點樣量成正比。經16S rDNA測序比對結果表明，不同上樣量會導致電泳條帶顏色深淺不同而序列比對結果不變，菌株7 與53 最相似屬種均為Bacillus subtilis。而菌株21 最相似屬種始終為Enterobacter ludwigii，這說明上樣量不同時不影響對菌株間親緣關系的判斷，16S rDNA 測序結果與此次電泳試驗結果一致，再次說明SDS-PAGE 在對內生菌輔助測定過程中是一種有效的方法與手段。

內生菌 123、125、132 不同上樣量的 SDS-PAGE圖譜見圖5。

圖5 菌株123、125、132 不同上樣量的SDS-PAGE 圖譜（M：蛋白標記）Fig.5 The SDS-PAGE electrophoresis of 123，125，132 different sample volume with repeats（M：protein marker）

從圖5可知，上樣量為 7 μL 和 14 μL 時蛋白質條帶電泳后各蛋白質亞基的相對遷移率幾乎沒有變化，只是顏色深淺有稍微變化，這說明分子量不隨點樣量的變化而變化，但蛋白質含量與點樣量成正比。經16S rDNA 測序比對分析表明，上樣量不同時，菌株123 的最相似屬種始終為Bacillus cereus、菌株125 的最相似屬種始終為Bacillus cereus、菌株132 的最相似屬種始終為Bacillus aryabhattai，且三者最相似菌株也不因上樣量不同而變化，說明上樣量不同不影響對親緣關系遠近的判斷。16S rDNA 測序結果與此次電泳試驗結果一致，再次說明SDS-PAGE 是一種鑒定內生菌的有效輔助手段。

3 結論與討論

大豆根瘤內生菌蛋白質條帶與菌株16S rDNA 序列比對結果的關系。植物內生菌種類繁多，獲得優良菌株并對其測序和序列比對是研究內生菌的首要問題，一直受到廣泛關注[19]。Schagger H 等[14]在 20世紀首次利用16S rDNA 的序列構建了PCR 引物，通過擴增和DNA 測序，鑒定未知功能的細菌，開辟了使用16S rD NA 序列分析未知細菌的先例。由于16SrDNA 廣泛存在于原核生物中，且具有種屬特異性，故16S rDNA 序列分析法逐漸成為鑒定植物內生菌種類的常用方法[20-22]。本試驗從大豆根瘤中篩選優良菌株，并對其可溶性蛋白質進行蛋白電泳檢測，將所得結果與16S rDNA 測序比對分析結果進行分析[20]。結果表明，菌株7 與53的蛋白圖譜大致相同，幾乎沒有差異。經16S rDNA 測序比對分析，兩者最相似屬種均為Bacillus subtilis，說明兩者很可能是同一種內生菌。湯旭等[21]通過對布魯氏菌進行16S rDNA 測序分析，得出在布魯氏菌中相似度極高，與本試驗結論一致。電泳結果顯示，對同一菌株不同上樣量不影響蛋白質圖譜，經16S rDNA 測序，同一菌株的最相似屬種始終不變。陳亞飛等[23]通過對蛇毒抗瘤蛋白質的測定得出，含量較高、上樣量過高的條帶區分不明顯，而上樣量過低、蛋白質含量低的條帶不能顯示。可見，上樣量過低時影響蛋白質的準確性，而上樣量過高時影響蛋白質條帶的清晰度，進而影響蛋白質的分離鑒定[24]。根據內生菌SDS-PAGE電泳圖譜與16S rDNA 測序結果對比可知，內生菌中某些不同屬種之間的蛋白質圖譜存在差異，而相同屬種之間的蛋白質圖譜完全相同，上述結論對大豆根瘤內生菌的研究和初步判斷提供了有效的方法和基礎，但在準確判斷內生菌的種屬關系時，還要采用其它手段進一步鑒定[24]。

凝膠濃度對電泳結果的影響。由于SDS 的加入，使蛋白質樣品帶上大量負電荷從而掩蓋了蛋白質分子原有的電荷量，故在SDS-PAGE 電泳中樣品的遷移速度只取決于其相對分子質量而與其所帶的電荷及分子的形狀無關[15]。張露露等[25]試驗得出可通過膠板蛋白質分子量大小取決于分離的膠濃度大小，凝膠濃度低時適合分離分子量較大的蛋白質，而凝膠濃度高時適合分離分子量較小的蛋白質，又由于蛋白質分子量小、電泳速度快，蛋白質樣品容易跑出膠板，造成蛋白質條帶的缺失[24]，總體上，相對分子質量越小所用凝膠濃度就越大[13-14]，在本試驗中采用了5%的濃度，所以試驗效果不佳，出現了“拖尾”及“微笑”帶等一系列現象。在進行SDS-PAGE 時可通過對比不同濃度凝膠的分離效果確定最適濃度。

電泳前煮沸是否充分對電泳結果的影響。電泳效果與操作流程、電泳條件等因素密切相關，其中一個因素的改變就可能會影響試驗結果，故在電泳過程中應綜合考慮各種因素[24]。電泳前一般將待測樣品煮沸以將其二硫鍵斷裂，斷裂是否充分可能會影響電泳結果。袁燕等[17]通過對蒜頭果蛋白質進行變性SDS-PAGE電泳，通過觀察不同處理后樣品的相對遷移率得出蒜頭果蛋白質是由二硫鍵連接的兩個多肽鏈組成，不同處理得到的蛋白質樣品的電泳圖譜不同。在本試驗中，將待測樣品統一煮沸10 min，由于無法從表面判斷二硫鍵是否充分斷裂，只采用這種方法處理蛋白質樣品顯然是不合理的，這是試驗的不足之處。在試驗前可設置不同煮沸時間使蛋白質樣品不同程度的斷裂，然后進行SDS-PAGE 電泳，觀察蛋白質圖譜的差異以定制出適當的煮沸時間。