桶裝飲用水中銅綠假單胞菌的污染調查及分型

酈娟，董華夏，張珣，涂鳳琴，戴小芳，曾慧君，胡筱靜，楊永

（武漢食品化妝品檢驗所，湖北 武漢 430012）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），又稱綠膿桿菌，是一種非發酵革蘭氏陰性桿菌，在土壤、水、空氣、正常人的皮膚、呼吸道和腸道中廣泛存在，被世界衛生組織（world health organization，WHO）的危害分析關鍵控制點（hazard analysis critical control point，HACCP）評估為嬰兒瓶裝飲用水的危害指示菌[1]。銅綠假單胞菌在桶裝飲用水中的污染屢見報道，已逐漸成為桶裝飲用水質量不合格的主要指標。

對致病菌進行分型分析，對污染源的識別和污染途徑的追蹤有重要意義。分子分型技術已成為致病菌分型的重要手段[2]。常見的方法有基于脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）水平差別，例如脈沖場凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）、多為點序列測定（multi-locus sequence typing，MLST）、隨機擴增DNA 多態性（randomly amplified polymorphic DNA，RAPD）和核糖體分型（ribotyping）等方法[3-5]。近年來，基于蛋白質差別的分型技術也發展起來，例如基于基質輔助激光解析電離質譜（MALDI-TOF MS）技術和表面增強激光解吸電離飛行時間質譜（surface enhanced laser desorption/ionization time of flight，SELDI-TOF MS）技術的方法[6-7]。

對本地生產的82 批次桶裝水進行銅綠假單胞菌檢測，初步了解桶裝水中銅綠假單胞菌的污染情況，并對分離出的銅綠假單胞菌采用核糖體分型和基質輔助激光解析電離質譜技術的方法進行分型分析，可建立桶裝飲用水中銅綠假單胞菌數據庫，為桶裝水中銅綠假單胞菌的污染溯源積累數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CN 瓊脂、金氏B 瓊脂、乙酰胺肉湯和綠膿菌素測定培養基：購自北京陸橋技術股份有限公司；Riboprinter 系統EcoRⅠ試劑套裝、Riboprinter 系統樣品制備包：購自美國杜邦公司；三氟乙酸（色譜純）、乙腈（色譜純）：購自賽默飛世爾科技有限公司；α-氰基-4-羥基肉桂酸（HCCA），細菌實驗標準品：購自德國布魯克公司；VITEK2 GN 鑒定卡：購自生物梅里埃公司。

1.2 儀器與設備

BSC-1300ⅡA2 生物安全柜：蘇州安泰空氣技術有限公司；VITEK2 compact system 全自動生化鑒定系統：梅里埃公司；SPX-Ⅱ生化培養箱：上海新苗醫療器械制造有限公司；Riboprinter 全自動微生物基因指紋鑒定系統：美國杜邦公司；基質輔助激光解析電離質譜 MALDI-TOF-MS/MS（autoflex speed）：德國布魯克公司。

1.3 方法

1.3.1 銅綠假單胞菌檢驗方法

按照GB 19298-2014《食品安全國家標準包裝飲用水》[8]規定，采用GB/T 8538—2008《飲用天然礦泉水檢驗方法》[9]中4.54 礦泉水中銅綠假單胞菌的檢測方法。分離株用VITEK2 compact system 進行確認。

分離株經革蘭氏染色后，根據染色結果選用鑒定卡按VITEK2 compact system 儀器操作說明進行生化鑒定。經過確認的分離株用于分型分析。將分離株在CN 平板上劃線，（36±1）℃培養 48 h。

1.3.3 核糖體分型

按照杜邦Riboprinter 全自動微生物鑒定系統操作程序進行。

將Riboprinter 生成的指紋圖譜與Riboprinter 數據庫比對。再將圖譜導入BioNumerics 軟件包，用UPGMA 法進行聚類分析，Pearson 相關系數為1%。

1.3.4 MALDI-TOF MS 分型

樣品制備。用滅菌牙簽刮取單菌落少量菌體，在靶板的靶點內涂成薄層。在其上覆蓋1 μL HCCA 溶液，自然晾干。

儀器參數：線性正離子（LP）采集模式；加速電壓：19.50 kV；檢測分子質量范圍2 000 Da～20 000 Da，激光頻率為500 Hz。每次試驗之前都用標準品溶液進行質量校正。用Flex Control 軟件進行數據采集，用Biotyper 和FlexAnalysis 軟件進行后續聚類分析。

采用電抗子模塊分段投切的模塊化多電平換流器降電容方法//李鈺,李帥,趙成勇,許建中,曹均正//(19):90

按照Biotyper 軟件使用說明，鑒定結果與銅綠假單胞菌匹配分數為1.700 以上的，為銅綠假單胞菌。進一步確認后的菌株蛋白質指紋圖用FlexAnalysis 軟件分析，相似性判定水平為50%。

2 結果與分析

2.1 銅綠假單胞菌的檢測結果

在2016年桶裝飲用水82 批次樣品中18 批次檢出銅綠假單胞菌，檢出率為22.0%，各季度結果見表1。

表1 2016年各季度桶裝飲水中銅綠假單胞菌檢出率Table 1 Detection rate of Pseudomonas aeruginosa in bottled drinking water in 2016

表1 每個批次檢測5個樣品，每批次檢出銅綠假單胞菌的樣品數范圍在1～4，樣品中銅綠假單胞菌計數范圍在1 CFU/250 mL～320 CFU/250 mL，具體見表2。

表2 各批次中銅綠假單胞菌計數情況Table 2 Counting of Pseudomonas aeruginosa in batchs

續表2 各批次中銅綠假單胞菌計數情況Continue table 2 Counting of Pseudomonas aeruginosa in batchs

2.2 銅綠假單胞菌的核糖體分型結果

將從樣品中分離得到的36 株銅綠假單胞菌用杜邦Riboprinter 全自動微生物基因指紋鑒定系統進行核糖體分型，鑒定結果均為銅綠假單胞菌。用BioNumerics 軟件進行聚類分析，結果分為2個大群，其中1群包括16 株，2 群包括20 株，每群再分為了2個亞群。結果見圖1。

圖1 36 株銅綠假單胞菌分離株核糖體分型結果Fig.1 Clustering of ribosome typing of 36 Pseudomonas aeruginosa

2.3 銅綠假單胞菌的MALDI-TOF MS分型

將從樣品中分離得到的36 株銅綠假單胞菌用進行MALDI-TOF MS 分型，通過對蛋白質指紋圖譜進行聚類分析，按照50%相似性作為判定水平，36 株菌可被分為2個大群，其中1 群包含16個菌株，2 群包含20個菌株，其中1 群又分為2個亞群，分別包含8個菌株，結果見圖2。

圖2 36 株桶裝水來源的銅綠假單胞菌MALDI-TOF MS 分型結果Fig.2 Clustering of typing analysis of 36 Pseudomonas aeruginosa by MALDI-TOF MS

2.4 兩種分型結果的比較

2.4.1 比較來源于同一批次的不同樣品中分離出的菌株的分型結果

來源于同批次樣品的菌株632-19-S-1、632-19-S-3 和 632-19-S-5，核糖體分型和 MALDI-TOF MS 分型都被歸為同一亞群。但在核糖體分型中632-19-S-1和632-19-S-5 更相似，而在MALDI-TOF MS 分型中632-19-S-1 和 632-19-S-3 更相似。

來源于同批次樣品的菌株632-18-S-1、632-18-S-2、632-18-S-3 和632-18-S-4 在兩種分型分析中也都歸在了同一亞群。在核糖體分型中632-18-S-1 和632-18-S-4 更相似，632-18-S-2 和 632-18-S-3 更相似。而在 MALDI-TOF MS 分型中，632-18-S-1 和 632-18-S-2 更相似，632-18-S-3 和 632-18-S-4 更相似。

來源于同批次樣品的菌株632-17-S-8、632-20-S-3 和632-20-S-4 在兩種分型分析中也都歸在了同一亞群。在核糖體分型中632-20-S-3 和632-20-S-4更為相似，而在MALDI-TOF MS 分型中632-17-S-8和632-20-S-4 更為相似。

來源于同批次樣品的菌株632-19-S-7、632-19-S-8 和 632-20-S-2。在核糖體分型中，632-19-S-7 和一 632-19-S-8 歸為 1個亞群，632-20-S-2 歸為另一個亞群。在MALDI-TOF MS 分型中，3個菌株分為同一亞群，其中632-19-S-7 和632-19-S-8 更為相似。

2.4.2 比較來源同一生產廠家的不同批次樣品中分離出來的菌株的分型結果

菌株 632-17-S-1、632-17-S-2、632-17-S-3、632-17-S-4 和 632-17-S-6、632-17-S-7 來自同一生產廠家不同批次。在核糖體分型中，4個菌株歸為同一亞群。在MALDI-TOF MS 分型中，632-17-S-7 和其他3個菌株歸在一個大群下的兩個不同亞群。

菌株 632-18-S-5、632-18-S-6、632-18-S-7、632-18-S-8 和 632-21-S-3、632-21-S-4 來源于另一廠家的不同批次樣品。在核糖體分型中，632-21-S-4與其他菌株歸在不同大群，632-18-S-5 和632-21-S-3 與 632-18-S-6、632-18-S-7 和 632-18-S-8 歸在同一大群的兩個亞群。在MALDI-TOF MS 分型中，632-21-S-3 和其他菌株分在不同亞群。

可見，核糖體分型和MALDI-TOF MS 分型的結果不完全一致，可能是因為核糖體分型針對的是DNA 水平，與酶切和電泳情況有關，而MALDI-TOF MS 分型針對的是蛋白質水平，與菌株的生長狀態有關。

3 討論

在國家標準將銅綠假單胞菌列為包裝飲用水的致病菌檢測指標之一后，桶裝飲用水中銅綠假單胞菌的污染情況日益受到重視。很多地區的桶裝飲用水中銅綠假單胞菌的污染率在8%以上[10-13]，此次調查中銅綠假單胞菌的檢出率為22.0%，污染情況同樣不容忽視。其中第3 和第4 季度的檢出率明顯高于第1 和第2 季度，與之前其他研究者的研究結論一致[10]。每批次檢出的陽性樣品數均小于5，說明生產中銅綠假單胞菌的污染具有不均一性和隨機性。銅綠假單胞菌已成為桶裝水的重大安全隱患。

銅綠假單胞菌的污染源很多。水源水污染、制水過程中的過濾、反滲透設施、貯水罐和管道等消毒不徹底和交叉污染、回收空桶及蓋清洗消毒不到位和桶蓋密封不嚴都有可能是銅綠假單胞菌污染的途徑[14]。對銅綠假單胞菌的分型分析，可以進一步了解銅綠假單胞菌的污染程度和污染來源，實現污染溯源，便于污染的消除和預防，有利于桶裝水生產企業的規范生產。脈沖場凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）是目前公認的病原菌分子分型和溯源研究的“金標準”，但是其操作比較復雜，對技術人員要求較高[15]。而核糖體分型目前已實現自動化[16-17]，MALDI-TOF MS分型的操作也相對簡單[6]，對于致病菌的分型和污染溯源具有重大意義。后期結合分型結果，建立地區銅綠假單胞菌數據庫，可以為桶裝水中銅綠假單胞菌的污染溯源積累數據，為后續桶裝水中銅綠假單胞菌的防控提供技術支持。