長白山東坡不同海拔落葉松土壤微生物碳代謝及酶活性研究

段益莉，李繼俠，江強，趙鴻宇

1. 內江職業技術學院，四川 內江 641100；2. 鄭州科技學院，河南 鄭州 450064；3. 北京林業大學園林學院，北京 100083

土壤酶是催化土壤有機物質分解的蛋白質，主要來源于微生物、植物根系及動物的分泌釋放（Xu et al.，2017；Kaurin et al.，2018）；它參與土壤中有機物質轉化的全過程，直接或間接影響著土壤一系列的生物化學反應，對生態系統的物質循環產生重要影響（Wu et al.，2017；Esch et al.，2017）。土壤呼吸作為土壤碳通量和陸地生態系統碳循環的關鍵成分，土壤呼吸的微小變化將對大氣碳熱平衡產生巨大影響（Li et al.，2017；Bond-Lamberty et al.，2018）。土壤呼吸速率很小的變化都將使大氣CO2濃度和土壤碳吸存發生巨大的改變，在全球尺度，森林土壤呼吸釋放的CO2量為77 Pg·a-1（以C計，下同），僅次于全球總初級生產力（100－120 Pg·a-1），大于全球陸地生態系統的凈初級生產力（50－60 Pg·a-1）（Mayer et al.，2017；Bréchet et al.，2017），準確評估土壤呼吸作用及其對全球變化的響應具有十分重要的意義。土壤微生物參與土壤有機質分解、腐殖質形成、土壤養分轉化和循環等過程，是土壤生物化學特征的重要組成部分，在評價土壤肥力、環境監測、土地利用等方面有廣泛的作用（Bore et al.，2017；Müller et al.，2017）。受技術和方法的限制，以往的研究多側重于對微生物數量等研究，而表現土壤微生物在組成和區系上的變化，還要結合土壤微生物多樣性的研究。近年來，生物化學及分子生物學等測試技術的進步，推動了土壤微生物多樣性的研究（Hernández et al.，2017；Zhang et al.，2017）。對土壤微生物多樣性的研究主要從物種、功能和遺傳多樣性3個層面展開的，其中碳素利用法、磷脂脂肪酸（PLFA）分析法和核酸分析法是研究微生物多樣性普遍采用的 3種技術。其中，碳素利用法通常采用Biolog微平板法，其理論依據是Biolog-Eco微平板代謝多樣性類型的變化與群落組成（Joergensen et al.，2018）。Biolog-Eco微平板是對功能微生物群落變化較為敏感的指標，被廣泛應用于評價土壤微生物群落的功能多樣性，也可以用于估價土壤微生物群落代謝多樣性和功能多樣性的研究。

長白山地處中國北方中緯度，屬典型的溫帶大陸性季風氣候區，是中國氣候變化比較劇烈的地區（牟長城，2003；張先亮等，2010）。該地區生境條件豐富多樣，具有完整的森林生態系統。該區歷史上曾有多次火山噴發，火山噴發釋放的大量火山碎屑物在強勁偏西風的作用下主要沉積在長白山東坡，導致該區域植被數次被毀滅。與北坡具有的完整的植被帶相比，東坡植被無明顯的垂直分異，從山腳到山頂處均為長白落葉松（Larix olgensis）純林（呂林昭等，2008）。由于東坡長白落葉松海拔分布范圍廣，長白落葉松又是該地區森林演替的一個過渡樹種，因此，對不同海拔高度的長白落葉松和氣候之間關系的研究，對預測未來氣候變化情景下長白落葉松的演替趨勢具有指導作用。鑒于此，基于2013－2017年連續5年對長白山東坡不同海拔落葉松土壤微生物碳代謝及酶活性調查分析數據，利用Biolog-Eco微平板法研究土壤微生物碳代謝及酶活性，旨在進一步加強對土壤微生物碳代謝特征的了解，為揭示森林生態系統土壤微生物碳代謝特征和酶活性的監測提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

長白山（41.52°－2.47°N；127.15°－128.92°E）位于中國吉林省東南部中朝交界處，為中國乃至全球自然生態系統保存最為完整的一個地區。該區氣候特征為受季風影響的溫帶大陸性季風氣候，春季多大風，夏季溫暖多雨，秋季涼爽多霧，冬季寒冷漫長，溫度與降水四季變化明顯。長白山地區雨熱同期，降水導致的干濕季節差異明顯。年平均氣溫-7.04 ℃，1月份最冷（-22.89 ℃），7月份最熱（8.67 ℃），年降水量為1361 mm，降水主要集中在6－8月，約占全年降水量的 62%以上。長白山北坡具有明顯的植被垂直更替。隨海拔升高，植被依次為闊葉林帶（海拔＜500 m）、闊葉紅松林帶（海拔500－1100 m）、云冷杉林帶（海拔1100－1700 m）、山地岳樺林帶（海拔1700－2000 m）和位于火山錐體上部的高山苔原帶（海拔＞2000 m）。這種完整的垂直帶譜僅在北坡比較典型，其他坡向不明顯或無垂直分異，尤其是東坡，從山底到山上均為長白落葉松林，其年平均氣溫和降雨量如圖1所示。

1.2 試驗設計

圖1 研究區近5年平均氣溫和降水量月值變化Fig. 1 Mean temperature and precipitation in recent 5 years in study site

分別在長白山東坡3個海拔設立樣地進行調查采樣，群落均為未受人為干擾的原始林，其中高海拔（1990 m）、中海拔（1652 m）和低海拔（1447 m）樣地各3個，分別于2013年8月－2017年8月調查取樣。高海拔落葉松由于常年受山頂強風的影響，呈典型的旗形樹冠，為長白落葉松純林，郁閉度約為0.91。中海拔和低海拔采樣點郁閉度分別為0.92和0.94。于2012年8月建立固定樣地，面積為1 hm2，林木優勢年齡170 a，平均胸徑29.0 cm，平均樹高24.0 m，苔蘚層發達。

1.3 土壤呼吸和酶活性測定方法

在研究區布設監測點并標記，在第一次測定土壤呼吸（MR）之前，提前一天將測定基座嵌入土壤中，將每個基座內存留的地表植被自土壤表層徹底剪除，聚氯乙烯圓柱體經過24 h平衡后，土壤呼吸速率可恢復至基座放置前的水平，從而避免了因安置氣室對土壤產生擾動而造成的短期內呼吸速率波動。采用動態密閉氣室紅外CO2分析儀（IRGA）法，測定儀為美國Li-6400便攜式氣體分析系統和Li-6400土壤呼吸室，土壤呼吸日變化測定為白天每隔2 h測定1次，在06:00－18:00點之間測量，每個監測點1次測定2個平行取平均值。在觀測土壤呼吸的同時，使用手持長桿電子溫度探針測定 0－10 cm深處的土壤溫度，同時使用TDR測定每個監測點附近0－10 cm范圍內的土壤濕度。采集不同海拔監測點0－10 cm混合土樣兩份，帶回實驗室，一份自然風干（15－20 d），去除碎片和部分根后過 0.5 mm篩，測定土壤微生物量碳含量（MBC）；另一份保存于4 ℃冰箱中，用于測定土壤酶活性和微生物多樣性。

土壤微生物呼吸即土壤基礎呼吸的測定采用堿液吸收法；土壤微生物代謝熵（qCO2）為土壤微生物呼吸與土壤微生物生物量碳（MBC）的比值，計算公式為：qCO2=MR/MBC（Mayer et al.，2017；Bréchet et al.，2017）。

土壤水解酶活性的測定均采用對硝基苯酚（pNP）法。分別以對硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷、對硝基苯酚乙酰基氨基葡萄糖苷、L-亮氨酸-4-硝基苯胺和對硝基苯磷酸二鈉為底物測定糖苷酶、幾丁質酶、亮氨酸氨基肽酶以及磷酸酶的活性（Xu et al.，2017；Kaurin et al.，2018）。

土壤微生物群落功能多樣性可以用Shannon多樣性指數（H）、McIntosh指數（E）和 Simpson指數（Ds）來表征，在計算Simpson指數時，將數據擴大1000倍。采用Biolog-Eco微平板溫育150 h的數據進行多樣性分析。Biolog-Eco微平板中單一碳源的反應程度，即土壤微生物對單一碳源的利用能力，采用平均每孔顏色變化率（Average well color development，AWCD）來描述。AWCD值較大表示土壤微生物具有較高的碳源利用能力和微生物豐度，AWCD的計算公式為（Bore et al.，2017；Müller et al.，2017）：

式中，Ci為第i孔的吸光值；R為對照孔的吸光值。對于(Ci-R)＜0 的孔，將其記為 0，即(Ci-R)≥0。

式中，Pi為第i孔的相對吸光值與整個微平板的相對吸光值總和的比值，計算公式：

N為被利用碳源的總數，吸光值≥0.25所有微孔的總和。

運用Excel 2003整理數據，SPSS 13.00對數據進行單因素方差分析（One-way ANOVA），采用LSD法進行差異顯著性檢驗。采用CANOCO 5.0中的排序分析法分析土壤酶活性與微生物多樣性之間的關系。

2 結果與分析

2.1 不同海拔落葉松土壤微生物群落代謝平均顏色變化率

微生物群落功能多樣性能夠反映土壤中微生物的生態功能，采用Biolog-Eco微平板加入的碳源一般是植物根系分泌物，更能代表根際土壤微生物群落可利用的碳源，與土壤微生物群落的生態功能更具相關性。平均顏色變化率（AWCD）是判斷土壤微生物群落利用碳源能力的重要指標之一，代表土壤微生物的代謝活性。不同海拔落葉松土壤開始培養后每隔24 h測定AWCD值，得到AWCD隨時間的動態變化圖（圖 2），由圖可知，隨著培養時間的延長，不同海拔落葉松土壤微生物碳源利用總體上呈逐漸增加的趨勢，培養初期25 h內AWCD變化不明顯，不同海拔落葉松土壤微生物碳源利用在培養25－75 h內AWCD快速增長，此時微生物活性旺盛，75 h后增長緩慢，150 h后急劇增長；在培養50 h以前，不同海拔落葉松土壤微生物碳源利用基本相一致，在50 h以后，相同時間土壤微生物碳源利用大致表現為低海拔＞中海拔＞高海拔，局部有所波動。

圖2 不同海拔落葉松土壤微生物群落代謝平均顏色變化率Fig. 2 Average metabolic color change rate of soil microbial community along an altitudinal gradient

2.2 不同海拔落葉松土壤微生物對碳源利用強度

土壤微生物多樣性反映了群落總體的變化，但未能反映微生物群落代謝的詳細信息。根據不同海拔落葉松土壤微生物碳源利用情況（表 1），綜合考慮其變化趨勢，選取光密度增加較快的150 h的AWCD值進行土壤微生物群落代謝多樣性分析，按化學基團的性質將ECO板上的碳源分成6類：氨基酸類、碳水化合物類、羧酸類、聚合物、胺類、酚酸類，6類碳源均呈現出隨培養時間的延長，微生物利用碳源的量逐漸增加的趨勢。由表可知，土壤微生物對不同種類碳源的利用強度存在較大差異。不同海拔落葉松土壤微生物對6種不同碳源的利用率表現大致相同，5年內平均值基本表現為低海拔＞中海拔＞高海拔，不同海拔氨基酸類、碳水化合物類、羧酸類、胺類和酚酸類差異均顯著（P＜0.05），低海拔和中海拔聚合物類差異不顯著（P＞0.05），二者顯著高于高海拔（P＜0.05）。總體而言，2013－2017年，不同海拔氨基酸類、碳水化合物類、羧酸類、聚合物、胺類、酚酸類均呈增加趨勢，且碳水化合物和羧酸類碳源是不同海拔落葉松土壤微生物的主要碳源，其次為氨基酸類、酚酸類和聚合物類，胺類碳源的利用率最小。

表1 不同海拔落葉松土壤微生物對碳源利用強度Table 1 Soil microbial utilization intensity of carbon source along an altitudinal gradient

2.3 不同海拔落葉松土壤微生物群落多樣性

微生物群落多樣性指數可用來指示土壤微生物群落利用碳源的程度，根據培養第 150小時的AWCD值計算土壤微生物群落的物種豐富度指數（H）、均勻度指數（E）、優勢度指數（Ds）和碳源利用豐富度指數（S）。結果表明（表2），不同海拔落葉松土壤微生物群落各多樣性指數從 2013－2017年基本呈增加趨勢；5年內物種豐富度指數（H）、均勻度指數（E）和碳源利用豐富度指數（S）平均值基本表現為低海拔＞中海拔＞高海拔，并且不同海拔差異均顯著（P＜0.05）；5年內優勢度指數（Ds）表現為低海拔=中海拔＞高海拔，不同海拔優勢度指數（Ds）差異不顯著（P＞0.05）。

表2 不同海拔落葉松土壤微生物群落多樣性Table 2 Soil microbial community diversity along an altitudinal gradient

2.4 不同海拔落葉松土壤呼吸及微生物代謝熵

表3為不同海拔落葉松土壤呼吸及微生物代謝熵，由表可知，2013－2017年不同海拔落葉松土壤微生量碳、微生物呼吸和微生物代謝熵均呈增加趨勢；5年內土壤微生量碳、微生物呼吸和微生物代謝熵平均值基本表現為低海拔＞中海拔＞高海拔，并且不同海拔差異均顯著（P＜0.05）。

2.5 不同海拔落葉松土壤酶活性

表4表明不同海拔落葉松土壤酶活性有一定的差異，2013－2017年，不同海拔落葉松土壤糖苷酶、幾丁質酶、亮氨酸氨基肽酶、堿性磷酸酶、酚氧化酶δ和過氧化物酶δ均呈增加趨勢；5年內土壤糖苷酶、幾丁質酶、亮氨酸氨基肽酶、堿性磷酸酶、酚氧化酶δ和過氧化物酶δ平均值基本表現為低海拔＞中海拔＞高海拔，其中幾丁質酶、亮氨酸氨基肽酶、酚氧化酶δ和過氧化物酶δ在不同海拔差異均顯著（P＜0.05）；中海拔和高海拔糖苷酶差異不顯著（P＞0.05），二者顯著低于低海拔（P＜0.05）；同樣中海拔和高海拔堿性磷酸酶差異不顯著（P＞0.05），二者顯著低于低海拔（P＜0.05）。

表3 不同海拔落葉松土壤呼吸及微生物代謝熵Table 3 Soil microbial metabolic entropy along an altitudinal gradient

表4 不同海拔落葉松土壤酶活性Table 4 Soil enzyme activity along an altitudinal gradient

2.6 土壤酶活性與微生物群落多樣性之間相關性

土壤酶活性為土壤微生物的重要碳源和氮源，為探討土壤酶活性與土壤微生物群落多樣性之間的關系，進行了土壤酶活性與微生物群落多樣性相關性分析（表5和圖3）。由表5可知，糖苷酶與物種豐富度指數、土壤微生物量碳、土壤微生物呼吸和土壤微生物代謝熵呈極顯著的負相關（P＜0.01），與碳源利用豐富度指數呈顯著的負相關（P＜0.05）；幾丁質酶與土壤微生物量碳、土壤微生物呼吸和土壤微生物代謝熵呈顯著正相關（P＜0.05）；亮氨酸氨基肽酶與土壤微生物量碳、土壤微生物呼吸和土壤微生物代謝熵呈極顯著正相關（P＜0.01），與物種豐富度指數、均勻度指數、碳源利用豐富度指數呈顯著正相關（P＜0.05）；堿性磷酸酶與土壤微生物代謝熵呈極顯著正相關（P＜0.01），與土壤微生物量碳、土壤微生物呼吸呈顯著正相關（P＜0.05）；酚氧化酶δ與土壤微生物呼吸和土壤微生物代謝熵呈極顯著正相關（P＜0.01），與物種豐富度指數呈顯著正相關（P＜0.05）；過氧化物酶δ與土壤微生物呼吸和土壤微生物代謝熵呈顯著正相關（P＜0.05）。

圖3 土壤酶活性與微生物多樣性之間PCA排序圖Fig. 3 Sequence diagram in soil enzyme activity and microbial diversity

土壤酶活性與微生物多樣性之間 PCA排序分析表明：土壤微生物呼吸和土壤微生物代謝熵是箭頭連線最長且都與物種第1排序軸和環境第1排序軸呈極顯著正相關，說明它們在第1排序軸上的位置很大程度上反映了其生態特點，是影響微生物多樣性分布的主要環境因子。其中土壤幾丁質酶、亮氨酸氨基肽酶對土壤微生物群落功能多樣性貢獻為正，這是造成不同海拔落葉松土壤微生物群落多樣性差異的重要原因。

3 討論

作為土壤微生物碳代謝特征的重要方面，微生物生物量碳與微生物呼吸對環境變化敏感，能夠較早地指示生態系統功能的變化，是土壤生態系統的預警及靈敏指標（Ward et al.，2017；Xu et al.，2017；McMahon et al.，2017）。土壤微生物生物量碳是土壤有機質中活性較高的部分，是土壤活性有機碳庫的重要組成部分之一。土壤微生物生物量碳周轉時間很快，對環境變化十分敏感，可以在土壤碳庫產生變化之前反映出土壤微小的變化（Liang et al.，2017）。土壤微生物呼吸實質是微生物對土壤有機質的分解過程，即土壤有機質潛在的礦化速率。土壤微生物呼吸反映了土壤微生物的總體活性和土壤物質代謝強度，其變化與否以及變化方向表明了系統對脅迫的敏感程度和響應模式（Arcand et al.，2017；Srivastava et al.，2017）。微生物代謝熵反映了土壤微生物群落維持能量的大小及其對土壤有機成分的利用效率。它將土壤微生物生物量碳的大小與微生物整體活性有機地結合起來，是反映環境因素對微生物活性的影響的另一個敏感性指標（Zhou et al.，2017；Kéraval et al.，2017）。土壤微生物代謝熵小，意味著微生物呼吸所消耗的碳的比例小，而用于建造微生物細胞的碳的比例相對增大，土壤微生物利用碳的效率高，對土壤質量的維持起到一定作用（Sinsabaugh et al.，2017；Bailey et al.，2018）。本研究發現，不同酶種類在不同海拔差異有別，其中低海拔華北落葉松土壤土壤糖苷酶、幾丁質酶、亮氨酸氨基肽酶、堿性磷酸酶、酚氧化酶δ和過氧化物酶δ顯著高于中海拔和高海拔，這表明低海拔華北落葉松有利于有機物質的水解；同時也說明低海拔華北落葉松土壤微生物對有機碳的利用率高，故土壤復雜有機碳轉化的速度較高。

表5 土壤酶活性與微生物多樣性之間相關性Table 5 Correlation between soil enzyme activity and microbial diversity

平均顏色變化率（AWCD）是反映土壤微生物活性，即利用單一碳源能力的一個重要指標，在一定程度上反映了土壤中微生物種群的數量和結構特征（Hernández et al.，2017；Zhang et al.，2017）。AWCD值越大，表明細菌密度越大，活性越高；反之，細菌密度越小，活性越低。分析不同海拔落葉松土壤微生物群落的代謝活性發現，不同海拔落葉松土壤微生物活性呈現一致的變化趨勢，在整個培養過程中，低海拔落葉松土壤微生物對Biolog-ECO板中碳源的代謝能力明顯高于中海拔和高海拔，可能的原因是：低海拔落葉松土壤中存在著與Biolog-ECO板中碳源物質高度協調的微生物（其養分含量較高），植物殘體和根系分泌物數量都很多，導致進入土壤的新鮮有機物質顯著增加，這大大刺激了土壤微生物的生長和繁殖，促使其代謝活性顯著提高（Liang et al.，2017；Arcand et al.，2017）。因此，在微生物生長的溫度范圍內，隨著溫度升高，生長速度加快，微生物代謝活性增強。本研究中土壤微生物對不同種類碳源的利用強度存在較大差異，不同海拔落葉松土壤微生物對6種不同碳源的利用率表現大致相同，5年內平均值基本表現為低海拔＞中海拔＞高海拔，2013－2017年不同海拔氨基酸類、碳水化合物類、羧酸類、聚合物、胺類、酚酸類均呈增加趨勢，并且碳水化合物和羧酸類碳源是不同海拔落葉松土壤微生物的主要碳源，其次為氨基酸類、酚酸類和聚合物類，胺類碳源的利用率最小。

本研究表明，2013－2017年不同海拔落葉松土壤微生量碳、微生物呼吸和微生物代謝熵均呈增加趨勢；5年內土壤微生量碳、微生物呼吸和微生物代謝熵平均值基本表現為低海拔＞中海拔＞高海拔，并且不同海拔差異均顯著（P＜0.05）；土壤酶活性和土壤微生物群落多樣性也呈一致的變化規律。主要是由于隨著海拔的增加，植物凋落物和有機質含量降低，會顯著減少土壤微生物生物量碳、微生物呼吸，降低土壤微生物代謝熵，土壤微生物生長受到抑制，活性降低，微生物需要消耗大量能量來維持生存，對土壤養分的利用效率下降。低海拔地區土壤有機物質豐富，為土壤微生物生長提供更多碳源和可利用養分，促進土壤微生物的大量繁殖以及微生物的活動，導致土壤微生物對有機質的利用效率和礦化速率提高，在形成更多微生物生物量碳的同時釋放 CO2，進而使土壤微生物代謝熵降低（Bailey et al.，2018；Guan et al.，2018）。此外，低海拔華北落葉松土壤微生物生物量碳、微生物呼吸及碳代謝效率最高，高海拔華北落葉松最低。主要原因為，（1）低海拔華北落葉松土壤凋落物含量高，土壤微生物通過產生特異性胞外酶分解外源有機質，同時也會分解土壤原有的有機質，進而引起激發效應。而外源有機質的多樣性越高，土壤微生物產生的胞外酶的多樣性越豐富，從而促進土壤原有有機質分解，使土壤原有有機質的微生物可利用性提高，有利于土壤中微生物的生長，進而導致低海拔華北落葉松土壤微生物生物量碳、微生物呼吸及碳代謝效率最高。（2）土壤微生物呼吸除了受到所利用底物質量的影響，還會受到溫度及含水量的影響。低海拔落葉松土壤水分和溫度較高，適當的水分含量有利于微生物生長繁殖，增強微生物的活性，促進土壤微生物呼吸（Kolton et al.，2017；Zhang et al.，2017；Bore et al.，2017）。

4 結論

（1）不同海拔落葉松土壤微生物群落代謝平均顏色變化率（AWCD）隨培養時間延長而逐漸增加，相同時間土壤微生物碳源利用大致表現為低海拔＞中海拔＞高海拔。土壤微生物對不同種類碳源的利用強度存在較大差異，碳水化合物和羧酸類碳源是土壤微生物的主要碳源，其次為氨基酸類、酚酸類和聚合物類，胺類碳源的利用率最小。

（2）2013－2017年，不同海拔落葉松土壤微生物群落各多樣性指數、土壤微生量碳、微生物呼吸、微生物代謝熵和酶活性均呈增加趨勢，基本表現為低海拔＞中海拔＞高海拔。

（3）相關性分析結果表明：土壤酶活性與微生物群落多樣性之間存在顯著的相關關系；物種豐富度指數（H）、均勻度指數（E）和碳源利用豐富度指數（S）與土壤酶活性的相關系數絕對值均高于優勢度指數（Ds），說明了土壤酶活性對土壤微生物群落優勢度指數的影響作用較小。此外，土壤酶活性與微生物多樣性之間 PCA排序分析表明：土壤微生物呼吸和土壤微生物代謝熵是影響微生物多樣性分布的主要環境因子。其中土壤幾丁質酶、亮氨酸氨基肽酶對土壤微生物群落功能多樣性貢獻為正，這是造成不同海拔落葉松土壤微生物群落多樣性差異的重要原因。