喀斯特石漠化區植被恢復不同階段土壤真菌群落組成分析

劉雯雯，喻理飛, ，嚴令斌，劉娜，趙慶

1. 貴州大學生命科學學院/農業生物工程研究院，貴州 貴陽 550025；2. 山地植物資源保護與種質創新教育部重點實驗室/山地生態與農業生物工程協同創新中心，貴州 貴陽 550025

以貴州為中心的西南地區是喀斯特連續分布最典型的區域（盛茂銀等，2013），具有高度異質性和脆弱性，易發生石漠化。植被退化是石漠化發展的重要原因和標志，退化喀斯特植被自然恢復一般有六個恢復階段，即草本群落階段、灌草過渡階段、灌木灌叢階段、灌喬過渡階段、喬林階段和頂極群落階段（喻理飛等，2002），不同植被下小生境土壤分布及其理化性質、土壤微生物存在差異（廖洪凱等，2013；廖洪凱等，2012；劉方等，2008），且與植被特征相關（Sayer et al.，2017）。

高通量測序是研究微生物群落組成的一種可靠且有效的方法（Bengtsson-Palme et al.，2013）。內轉錄間隔區（Internal transcribed spacer，ITS）擴增子測序是研究環境微生物多樣性及群落組成差異的重要技術手段之一，已被廣泛應用于真菌分類鑒定中（Bachy et al.，2013；Mago? et al.，2011）?？λ固貐^不同退化階段土壤微生物類群數量、微生物群落功能多樣性（胡芳等，2018；梁月明等，2010；宋敏等，2013；譚秋錦等，2014）等已有報道。真菌群落被正式描述的群落不到10%，未確定的分類信息高。本研究采用高通量測序、ITS擴增子測序技術對喀斯特區植被恢復不同階段小生境土壤真菌進行種類鑒定與分析，闡明退化喀斯特植被恢復過程土壤真菌群落組成及優勢關鍵類群，對深入認識喀斯特石漠化區植被恢復過程中土壤微生物作用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 研究區域概況

貴州省安順市鎮寧布依族苗族自治縣大山鎮位于貴州省西南部珠江水系與長江水系分水嶺之間（東經 105°35′－106°1′，北緯 25°25′－26°11′）。海拔356－1678 m，巖溶地貌分布廣，占全縣面積60%以上；屬北亞熱帶季風濕潤氣候，全年氣候溫和，雨量充沛；年平均氣溫 16.2 ℃，年平均日照時數為1142 h，年平均降水量1277 mm。研究區森林于 1958－1960年被采伐后，植被逐漸恢復，因存在不同干擾，研究區內出現草本群落階段、灌草過渡階段、灌木林階段和喬林階段群落，植被下發育有典型的石面、石溝、石縫等小生境。喬林階段以化香（Platycarya strobilacea）、黃連木（Pistacia chinensis）、海金子（Pittosporum illicioides）、樸樹（Celtis sinensis）為優勢種，灌木林主要有化香（Platycarya strobilacea）、針齒鐵仔（Myrsine semiserrata），灌草過渡階段主要有化香（Platycarya strobilacea）、異葉鼠李（Rhamnus heterophylla）、安順潤楠（Machilus cavaleriei），草本群落階段主要有白茅（Imperata cylindrica）、地果（Ficus tikoua）、沿階草（Ophiopogon bodinieri）、藎草（Arthraxon hispidus）。區域內巖石裸露率為10%－60%，成土母巖為石灰巖，土壤為石灰土，土壤pH介于6.9－7.9之間。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集

在典型的喬林階段（F）、灌木林階段（S）、灌草過渡階段（B）、草本群落階段（G）4個不同恢復階段分別設置樣地，在喬林階段設置20 m×20 m樣地，灌木林階段樣地、灌草過渡階段設置 4 m×10 m樣地，草本群落階段樣地為2 m×5 m，每個階段設置3個樣地，共12個。每個樣地內分別在石面（U）、石溝（D）、石縫（C）3種小生境內采集0－10 cm表層土壤樣品，共36個。每個土樣除去石塊和動植物殘體，混合均勻后，裝于密封袋中并編號，立刻放入液氮罐中速凍，帶回實驗室放入-70 ℃冰箱中保存，用于DNA提取。樣品保存在干冰中送上海美吉生物醫藥科技有限公司進行高通量測序。

1.2.2 DNA抽提和PCR擴增

根據土壤DNA提取試劑盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）說明書進行總 DNA 抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop 2000進行檢測，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量；選用引物 ITS1F：CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA；ITS2R：GCTGCGTTCTTCATCGATGC進行 PCR擴增。使用ABI GeneAmp? 9700型的PCR儀，擴增體系為 20 μL，2 μL 10×FastPfu 緩沖液，2 μL 2.5 mmol·L-1dNTPs，0.8 μL 引物（5 μM），0.2 μL rTaq聚合酶；10 ng DNA模板。擴增程序為：95 ℃預變性3 min，35個循環（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸10 min。PCR產物利用IlluminaMiseq PE 300平臺進行測序。

1.2.3 OTU聚類和注釋

根據Barcode序列和PCR擴增引物序列從下機數據中拆分出各樣品數據，截去Barcode和引物序列后使用FLASH（Su et al.，2012）對每個樣品的Reads進行拼接，得到原始Tags數據；參照QIIME的Tags質量控制流程，經過Tags截取、過濾及嵌合體去除等處理后得到高質量的有效Tags數據。利用UPARSE軟件，按照97%的相似度將序列聚類為OTU（sOperational Taxonomic Units），使用UCHIME軟件剔除嵌合體。利用RDP classifier對每條序列進行物種分類注釋。

1.2.4 統計分析

利用R語言vegan包根據豐度排名前50的類群繪制熱圖，從物種和樣品兩個層面進行聚類，分析各植被恢復階段的優勢真菌類群。通過 LEfSe（LDA Effect Size）系統分析植被不同恢復階段具有顯著差異的物種。

2 結果與分析

2.1 測序結果

樣本的物種多樣性隨測序量的變化情況可由Shanon-Winner指數曲線反映，如圖 1所示，曲線趨向平坦且文庫覆蓋率高于0.99，說明測序數據量足夠大，足以全面反映樣本中的微生物信息。

圖1 Shanon-Winner指數曲線Fig. 1 Shannon-Winner index curves

36個土壤樣品通過高通量測序及分析共獲得2437541條有效序列（表1），每個樣品獲得35911條有效序列，OTU數目為5437，分屬于6個門、31個綱、106個目、244個科及626個屬。

表1 測序結果Table 1 Statistics of sequencing data

2.2 土壤真菌群落組成

2.2.1 門分類水平上組成

喀斯特植被下土壤真菌群落在門分類水平上主要由 4類真菌組成，分別為子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、接合菌門（Zygomycota）和未分類真菌（Others/Unclassified fungi），占比分別為53.39%、25.08%、6.91%、14.20%，其中子囊菌門高于30%，為優勢菌群，擔子菌門與接合菌門占比不高但在所有樣品中均有出現，為常見菌群。

植被恢復不同階段土壤真菌群落門水平的組成也相同，均由子囊菌門、擔子菌門、接合菌門、未分類真菌組成，喬林階段分別占44.18%、30.66%、8.16%、16.29%，灌木林階段為49.06%、27.72%、6.36%、16.52%，灌草過渡階段為51.88%、31.89%、6.70%、8.96%，草本群落階段為68.43%、10.06%、6.40%、15.00%，可見恢復早期階段優勢菌群子囊菌門比例高，隨植被恢復逐漸下降。

2.2.2 屬分類水平上組成

在屬分類水平上，植被恢復不同階段土壤真菌群落組成屬及相對豐度（＞1%）如表2所示，其中，相對豐度＞5%的屬在喬林階段和灌木林階段相似，青霉屬Penicillium僅在灌木階段豐度稍高。

以樣品為單元，將各樣品中豐度排名前 50的屬利用R語言繪制熱圖，得36個不同生境下土壤真菌屬水平物種豐度聚類熱圖（圖2）。圖2表明：36個樣品中除草地石面樣品（GU3）、灌草過渡階段的石縫樣品（BC2）和草本群落階段石溝樣品GD1差異較大外，其余樣品可歸為3個土壤真菌組成類型，即類型1，由SD1/SD2/FC1/SD2/FD2/SD3/FD1/FU2/SU3/SC3/FC2/SU1/FC3/SU2/BU3/FD3組成，均為喬林階段與灌木林階段樣品，類型 2由BU1/BC1/FU3/BC3/BD1/BD3組成，絕大部分為灌草過渡階段樣品，類型 3由 GC2/GD2/GU1/BU2GU2/GC1/GD3/GC3/GD2組成，絕大部分為草本群落階段樣品。以樣品為單元的分類結果與植被恢復階段屬水平的土壤真菌群落組成一致，反映出在同一恢復階段小生境引起的土壤真菌群落組成變化小于植被恢復階段的影響。

植被各恢復階段土壤真菌群落相對豐度＞5%的物種屬組成（表2）如下：（1）喬林和灌木林階段有未分類真菌（11.90%－16.53%）、Geminibasidium（7.71%－11.90%）、被孢霉屬Mortierella（6.35%－8.13%）、蠟殼耳屬Sebacina（7.60%－9.73%）、青霉屬Penicillium（4.37%－6.78%）等；（2）灌草過渡階段有蠟殼耳屬Sebacina（22.96%）、子囊菌門 Ascomycota（11.26%），Geminibasidium（7.14%）、被孢霉屬 Mortierella（6.69%）、鐮刀菌屬Fusarium（5.29%）；（3）草本群落階段有未分類真菌（15.00%）、鐮刀菌屬Fusarium（12.88%）、子囊菌門 Ascomycota（13.40%）、被孢霉屬Mortierella（6.17%）、Archaeorhizomyces（5.85%）。

表2 植被不同恢復階段土壤真菌群落組成及相對豐度Table 2 Composition and relative abundance of soil fungi in different vegetation restoration stages

圖2 植被不同恢復階段土壤真菌的屬水平物種豐度聚類熱圖Fig. 2 Heat map of genus level abundance of soil fungi in different vegetation restoration stages

2.3 關鍵真菌類群分析

LEfSe分析可用于分析組間菌群差異，找出各組間差異的微生物種類。對上述3種土壤真菌群落組成類型進行LEfSe分析（LDA值默認為4），圖3表明：導致喬林、灌木林階段土壤真菌群落組成（類型1）具顯著差異并起關鍵作用的優勢關鍵物種屬是木霉屬 Trichoderma（LDA=4.11）、青霉屬Penicillium（LDA=4.35）、小蔓毛殼科Herpotrichiellaceae（LDA=4.00）、革菌科Thelephoraceae（LDA=4.10）和未分類真菌（LDA=4.86），灌草過渡階段（類型 2）是煤炱目Capnodiales（LDA=4.15）、格孢菌目 Pleosporales（LDA=4.28）、蠟殼耳屬Sebacina（LDA=5.30）、Geminibasidium（LDA=4.77），草本群落階段（類型3）是鐮刀菌屬Fusarium（LDA=4.78）、肉座菌科Hypocreales（LDA=4.54）、子囊菌門（LDA=4.63）、Archeaorhizomyces屬（LDA=4.48），支頂孢屬Acremonium（LDA=4.22）。

圖3 植被不同恢復階段土壤真菌物種LDA值分布柱狀圖Fig. 3 LDA score distrubution histogram of LEfSe analysis in different vegetation restoration stages

3 討論

3.1 喀斯特植被恢復不同階段真菌群落組成分析

利用高通量測序技術分析了喀斯特區植被恢復過程中4個階段土壤真菌群落組成結構，物種門組成結構分析結果表明，優勢真菌主要為子囊菌門、擔子菌門、接合菌門和未分類真菌；其中木霉屬 Trichoderma、青霉屬 Penicillium、小蔓毛殼科Herpotrichiellaceae、革菌科Thelephoraceae、蠟殼耳屬Sebacina、Geminibasidium、鐮刀菌屬Fusarium、Archeaorhizomyces、煤炱目Capnodiales、格孢菌目Pleosporales、子囊菌門 Ascomycota未定屬等為該地區的優勢關鍵屬。這與曾慶飛等（2015）認為貴州高原不同石漠化程度土壤真菌優勢菌群為球囊菌門，其優勢屬為曲霉屬 Aspergillus、鐮刀菌屬、被孢霉屬、球囊霉屬 Glomus等的研究結果不同。對黃土高原土壤（白麗等，2018）、納帕海高原濕地（陳偉等，2018）、寧夏沙漠土壤（郭成瑾等，2017）的研究發現其優勢真菌主要為子囊菌門、擔子菌門和接合菌門，另外還有其他豐度較低和目前數據庫無法鑒定的真菌門，其優勢屬為赤霉菌屬Gibberella、青霉屬、曲霉屬、鐮刀菌屬等，可見其在門水平上與喀斯特區植被恢復過程中土壤真菌群落組成相似，但優勢關鍵屬存在差異。

3.2 未鑒定真菌是未來深入研究的關鍵

無論是喀斯特地區，還是黃土高原、納帕海高原，土壤真菌群落組成中都存在豐度較低和目前數據庫無法鑒定的真菌門，黃土高原該類真菌占比約6.15%，納帕海高原該占比為 60%以上，本研究各植被恢復階段中門水平上的比例達 6.36%－16.52%，屬水平上的比例達8.96%－16.53%，因此，對喀斯特區土壤真菌類群庫的完善是土壤真菌鑒定及多樣性研究深入的關鍵。

3.3 喀斯特土壤真菌對參與養分循環吸收的影響

豐度占優勢的類群中蠟殼耳屬 Sebacina、革菌屬 Tomentella、外瓶霉屬 Exophiala、支頂孢屬Acremonium、黑團孢屬Periconia等屬于菌根真菌，菌根真菌的生物量與其分泌的代謝物是重要的碳匯且在土壤復雜的有機質降解過程中有重大貢獻，同時菌根真菌可利用土壤中的無機氨態氮、硝態氮、有機氮等有效提高對氮源的吸收利用（郭良棟等，2013）。木霉屬 Trichoderma、鐮刀菌屬 Fusarium不僅分泌纖維素酶對碳的分解起作用，其與青霉屬Penicillium、裸節菌屬Talaromyces都參與了土壤難溶性磷的溶解，有效提高植物對磷的獲取，是溶磷微生物的重要類群（楊順等，2018）。本研究中，喬林、灌木林兩階段中菌根真菌、溶磷真菌等種類豐度高，菌根的形成促進植物對土壤磷、氮的攝取吸收，參與養分分解礦化、硝化作用等過程（韋莉莉等，2016），參與有機質降解、氮循環、磷循環等養分循環，貢獻程度大；菌根真菌在灌草過渡階段豐度高；溶磷真菌在草本群落階段中豐度高，在活化土壤磷方面貢獻較大，增加土壤磷的供應，促進植物吸收利用（沈仁芳等，2015）。因此，深入研究喀斯特植被恢復過程中功能微生物的作用是重要的研究方向。

4 結論

喀斯特植被恢復過程中不同階段下土壤真菌群落組成分為3種類型：

類型1為喬林和灌木林階段，由未分類真菌、Geminibasidium、被孢霉屬 Mortierella、蠟殼耳屬Sebacina、青霉屬Penicillium、子囊菌門Ascomycota等組成，其中木霉屬 Trichoderma、青霉屬Penicillium、小蔓毛殼科 Herpotrichiellaceae、革菌科 Thelephoraceae、未分類真菌為該類型的關鍵優勢真菌類群。

類型2為灌草過渡階段，由蠟殼耳屬Sebacina、Geminibasidium、被孢霉屬 Mortierella等構成，其中，蠟殼耳屬 Sebacina、Geminibasidium、煤炱目Capnodiales、格孢菌目 Pleosporales未定屬為該類型的關鍵優勢真菌類群。

類型3為草本群落階段，由未分類真菌、鐮刀菌屬 Fusarium、子囊菌門 Ascomycota、被孢霉屬Mortierella、Archaeorhizomyces等構成，鐮刀菌屬Fusarium、Archeaorhizomyces、支頂孢屬Acremonium、肉座菌科 Hypocreales、子囊菌門Ascomycota未定屬為該類型的關鍵優勢真菌類群。