高遷移率族蛋白B1對人牙周膜干細胞增殖、分化影響的體外研究

徐賢寅 朱金曉 朱文婷 李曉丹

江蘇省無錫市兒童醫院口腔科 214023

高遷移率族蛋白B1(High mobility group box 1，HMGB1) 是一種具有高度保守性的DNA 結合蛋白，它在許多種細胞內均有表達，對細胞核的穩定、DNA轉錄、復制等功能具有重要的調控作用[1]。近年研究發現，HMGB1在特定的情況下，能被主動或被動地釋放到細胞外，具有類似于炎癥因子的作用，發生一系列生物學反應。人體的牙周組織具有極強的自我修復能力,這種能力來源于牙周膜內的一種未分化間充質細胞，其具有干細胞的特性，能自我更新并多向分化，故被稱之為牙周膜干細胞(human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs)[2-3]。一般情況下，牙周膜干細胞處于靜息狀態，以維持牙周膜的穩定狀態。當受到外界刺激時其隨之發生一系列反應，導致牙周組織的改變。筆者通過體外細胞實驗，觀察HMGB1對人牙周膜干細胞生物反應的影響，探討HMGB1在人牙周組織反應中的作用，以期為臨床上牙周炎的控制找到一個新的靶點。

1 材料與試劑

(1)主要試劑：高遷移率族蛋白B1 (R&D 公司,美國)；MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所)；引物由上海吉瑪公司合成；DMEM 培養基(Gibco公司，美國)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；地塞米松、維生素C、β-甘油磷酸鈉(Sigma公司,美國)；Ⅰ型膠原酶(Gibco公司，美國)。(2)主要材料：人牙周膜干細胞通過酶解組織法獲得并采用有限稀釋克隆法純化。

2 方法

2.1 人牙周膜干細胞的分離與培養 收集臨床上健康青年(20～25歲)拔除的牙周健康、無齲的新鮮第三磨牙，放無菌臺上，液漂洗3～5次，刮下根中1/3牙周膜，在含有2mg/mlⅠ型膠原酶的溶液中消化30min，離心后去上清，移入25ml培養瓶，加入完全培養液，于37℃、5%CO2、飽和濕度的孵箱中孵育。3d后開始每2～3d更換培養液1次，7～10d把組織去掉，收獲人牙周膜干細胞。取處于對數生長期的細胞的培養上清液，離心、過濾后，與培養基以1∶1比例混合培養，融合達到80%，用胰蛋白酶消化，作傳代培養細胞。取對數生長期的第1代細胞，調整細胞密度至5 000個/cm2，接種于96孔培養板中(1 500個/cm2細胞)。5d后換液，光鏡下觀察克隆形成情況。常規培養7～14d，至出現細胞克隆(細胞數≥50為判定標準)，待克隆長至孔底1/3～1/2后胰酶消化，轉移至24孔板擴大培養。

2.2 MTT實驗檢測HMGB1對人牙周膜干細胞增殖的影響 取培養的第三代人牙周膜干細胞，接種于96 孔細胞培養板中，在細胞培養箱內孵育24h。分成3組，兩組中分別更換含有100ng/ml和200ng/ml HMGB1的培養液，另一組作為空白對照。經HMGB1誘導培養后，分別在第1、3、5天取出1塊培養板，用MTT檢測試劑盒分析人牙周膜干細胞的增殖能力。操作參考試劑盒說明書。

2.3 RT-PCR法檢測人牙周膜干細胞中相關基因表達 取培養的第三代人牙周膜干細胞，接種于6 孔細胞培養板中，孵育24h。分成3組，兩組中分別更換含有100ng/ml和200ng/ml HMGB1的培養液，隔天換液，保證HMGB1濃度，另一組作為空白對照。經HMGB1誘導7d后，采用Trizol一步法提取細胞總RNA，20μl體系反轉錄1 000ng RNA，進行相關基因的RT-PCR反應：增殖細胞核抗原(PCNA)、白細胞介素-1b(IL-1b)、 腫瘤壞死因子α(TNFα)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)，各引物序列見表1。

表1 PCNA、IL-1b、TNFα和TRAP的引物序列

2.4 統計學方法 所有數據采用統計分析軟件SPSS21進行處理，各組數據間進行比較分析，P<0.05顯示差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 HMGB1對人牙周膜干細胞增殖的影響 經100ng/ml和200ng/ml的HMGB1誘導人牙周膜干細胞后，第3天和第5天經MTT檢測結果顯示，兩實驗組較對照組的OD值有明顯升高(P<0.05)(圖1)，實驗組間比較OD值差異無統計學意義(P>0.05)，說明HMGB1對hPDLSCs有促進增殖作用。經100ng/ml HMGB1誘導7d后，鏡檢顯示人牙周膜干細胞數量明顯增多，細胞增殖活躍，見圖2。

圖1 不同濃度HMGB1誘導對人牙周膜干細胞的增殖作用

圖2 100ng/ml HMGB1誘導對人牙周膜干細胞的增殖作用

注：A.誘導前，B.誘導7d后。

3.2 HMGB1對人牙周膜干細胞中PCNA、IL-1b、TNFα和TRAP基因表達的影響 兩種濃度的HMGB1(100和200ng/ml)誘導人牙周膜干細胞后，在第7天采用RT-PCR檢測發現兩實驗組較對照組中PCNA表達明顯增加(P<0.05)(圖3)，提示100和200ng/ml的HMGB1誘導使hPDLSCs的具有旺盛的增殖活性；同樣IL-1b、TNFα和TRAP的表達均明顯增加(P<0.05)，見圖4～6，說明100和200ng/ml的HMGB1誘導對hPDLSCs的破骨作用有明顯提高。

4 討論

與組蛋白類似，高遷移率族蛋白也是最重要的染色質蛋白之一。在細胞核中，HMGB1與核小體、轉錄因子和組蛋白相互作用，調控DNA轉錄。HMGB1在許多轉錄因子的相互作用中支持多種基因的轉錄，參與細胞復制、分化等重要生命活動。HMGB1存在于細胞核中的但當賴氨酸殘基上的過乙酰化可使它轉位到細胞質中。1999年，Wang等[4]發現HMGB1可以被釋放到胞外，局部出現類似于炎癥因子介導炎癥反應。隨后，HMGB1作為一種炎癥介質或促炎細胞因子逐步進入人們的視線，有研究表明HMGB1參與人體多種疾病的發展，如自身免疫性疾病，肺炎、糖尿病、腫瘤等[5-6]。

隨著對HMGB1的深入研究，HMGB1在牙周組織中的反應情況進入了口腔科醫生的視線。牙周炎是口腔內最常見的疾病之一，主要表現為牙周組織的慢性炎癥。通過對齦溝液成分的研究發現，作為一種外泌性炎癥介質，HMGB1在牙周炎患者的齦溝液的含量明顯增加，而健康人的齦溝液中則沒有變化[7]。筆者在前期的臨床研究中發現，齦溝液HMGB1 含量與牙槽骨吸收呈正相關性。成纖維細胞是牙周膜中最主要的細胞，參與牙周組織的一系列生理反應。孫欽峰等[8]通過對牙周膜成纖維細胞的研究發現，HMGB1能影響其細胞表面白細胞介素-6(IL-6)、破骨細胞核因子κB受體活化因子(RANKL)、骨保護因子(OPG)的表達，改變RANKL/OPG比值。

圖3不同濃度HMGB1誘導人牙周膜干細胞中PCNA的表達 圖4 不同濃度HMGB1誘導人牙周膜干細胞中IL-1b值不同 圖5不同濃度HMGB1誘導人牙周膜干細胞中TNFα的表達 圖6 不同濃度HMGB1誘導人牙周膜干細胞中TRAP的表達

牙周膜干細胞作為成體干細胞中較年輕的一員,于2004年首次由Seo 等[9]獲得，它平時在牙周膜組織處于靜息狀態,維持牙周組織穩態,當局部因素導致牙周膜損傷時，這些干細胞能增殖、分化，促進牙周組織修復、再生。本實驗中MTT檢測結果顯示，人牙周膜干細胞在HMGB1的誘導下，在第3天、第5天已經表現出明顯的增殖反應，提示牙周組織在炎癥情況下，HMGB1能引起人牙周膜干細胞增殖。細胞因子PCNA是一種位于細胞核內的DNA聚合酶δ的輔助蛋白，其變化情況與DNA的合成有關[10]。本實驗中人牙周膜干細胞經HMGB1誘導后，第7天RT-PCR檢測結果發現PCNA表達明顯增加，進一步證實hPDLSCs處于旺盛的增殖狀態。

IL-1是一種多功能細胞因子，在牙周組織中能通過介導一系列炎癥反應，進而導致牙槽骨吸收和膠原降解，促進牙周炎進一步發生，最終導致牙齒松動、脫落[11]。TNF是一種內源性炎癥細胞因子，與感染性疾病密切相關。通過對牙周炎患者的檢查發現，在其牙周組織中以及齦溝液中檢測到大量的TNF，其含量的高低與牙周炎的活躍程度相關，其含量越高牙周組織的破壞程度越嚴重[12]。TRAP是破骨細胞的特征性酶，TRAP參與骨基質中固體鈣磷礦化底物的降解，其表達和分泌與破骨細胞功能密切關系，調控TRAP的表達促進破骨過程，減少成骨[13]。本實驗結果顯示，人牙周膜干細胞經HMGB1誘導后，第7天IL-1、TNF表達明顯增加，說明其能促進炎癥反應；TRAP表達的明顯增加，提示細胞的破骨功能得到加強。

本次實驗的結果顯示，人牙周膜干細胞能被HMGB1刺激發生增殖，使得局部炎癥反應放大，同時破骨作用也得到了加強。這一實驗結果提示：HMGB1在牙周組織的破壞中起到重要作用。如何利用HMGB1作為靶點進行牙周炎癥控制，同時促進牙周組織修復再生，需要在今后的工作中進行更深入的研究。