草地早熟禾NADH-GOGAT基因的克隆及表達分析

陳 陽，孫華山，王玉書, 張學通，師 冉，熊良兵，金一鋒*

(1. 齊齊哈爾大學生命科學與農林學院，抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江省重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006； 2. 東北農業大學園藝園林學院，黑龍江 哈爾濱 150030)

草地早熟禾(Poapratensis)作為優質的冷季型草坪草，憑借良好的坪用性狀及耐寒性廣泛應用于我國北方的園林綠化[1]。植物氮素利用效率與水分利用效率密切相關，兩者也是節水農業的熱點與難點。草地早熟禾喜肥喜水，缺氮、缺水易造成植物萎蔫，葉色發黃，病害加重。我國北方城市水資源匱乏，而且氮肥的利用率較低，氮肥的過度施加易造成經濟和資源的浪費，不利于資源節約型生態社會的建設，水分及氮素營養制約著草坪業的健康發展。如何進一步實現草地早熟禾在節水條件下對氮素的高效利用，已經成為草業領域不可忽視的問題。

GS/GOGAT(Glutamine synthetase/Glutamate synthase，谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶)循環是植物氮同化的主要途徑[2]，植物通過對硝態氮的還原、植物衰老氮素再利用、根瘤菌固氮和氨基酸代謝等途徑獲得氨，將谷氨酸和氨態氮通過GS酶的催化反應生成谷氨酰胺，然后谷氨酰胺和酮戊二酸經過GOGAT酶的催化形成谷氨酸和其他氨基酸供植物利用。GS/GOGAT的同工酶活性相關研究較為深入。針對油菜(Brassicanapus)[3]研究發現，缺氮時GOGAT對子粒氮素積累、作物產量形成及作物體內氮素再利用影響很大，GS影響較小。甜菜(Betavulgaris)[4]葉片銨態氮的同化以GS2/GOGAT為主。不同基因型大豆葉片NADH-GOGAT的活性變化存在差異。目前擬南芥(Arabidopsisthaliana)[5]、水稻(Oryzasativa)[6]、大麥(Hordeumvulgare)[7]、玉米(Zeamays)[8]等多種植物的GS基因被成功克隆，且功能研究較深入。大部分GS/GOGAT循環的研究更多的關注GS在氮同化過程中的作用，而忽視了GOGAT的作用。GOGAT是連接氮無機和有機同化的紐帶，在作物氮代謝中具有重要作用。GOGAT主要以2種形式作用于植物中，一種形式為Fd-GOGAT，其功能與光合作用和呼吸作用有關，主要位于質體和葉綠體中；另一類為NADH-GOGAT，參與氮類化合物的轉移運輸，主要位于根瘤菌、根、莖和細胞質中。水稻[9]中NADH-GOGAT有利于生長器官中轉運來的谷氨酰胺的再利用。紫花苜蓿(Medicagosativa)[10]NADH-GOGAT基因在根瘤中共生固定氮同化成氨基酸過程中起主要作用。擬南芥[11]NADH-GOGAT在非光致呼吸性氨同化和谷氨酸合成中對植物發育的起重要作用，Fd-GOGAT參與氮的初級吸收與光呼吸釋放氨的再吸收。目前，針對草坪草GOGAT的基因研究未有報道。本研究擬克隆得到草地早熟禾NADH-GOGAT基因，并進行生物信息學分析，包括蛋白質結構預測，同源進化分析，功能結構域分析等。通過實時熒光定量PCR分析NADH-GOGAT基因在不同組織部位，氮素調控、干旱脅迫及水氮互作中表達情況。本研究為探究草地早熟禾NADH-GOGAT基因的功能，進一步研究草地早熟禾GS/GOGAT循環的調控過程奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

選取草地早熟禾‘午夜2號’為供試材料，購于北京克勞沃草業公司。植物總RNA提取試劑盒(DP432)購自于北京天根生化科技有限公司，PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit、PrimeSTAR?Max DNA Polymerase、TB GreenTMPremix Ex TaqTMII均購自于TaKaRa公司，引物合成和常規測序由上海生工公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1草地早熟禾幼苗的培養及相應脅迫的處理 研究挑選飽滿的草地早熟禾種子，將其播種于盆中(營養土∶沙子=2∶1)，培養4周后將健康的幼苗轉移到試驗田中。待幼苗高約10～12 cm時，將幼苗轉移至1/2Hoagland營養液中培養，每2 d換1次營養液，培養4周后，選取長勢一致的幼苗，進行脅迫處理。不同氮素濃度的處理：將1/2Hoagland營養液原有的氮源NH4NO3、Ca(NO3)2、KNO3都更換為NaNO3，設置不同氮素濃度的1/2Hoagland營養液，NN:0 mM NaNO3、LN:1.5 mM NaNO3、MN:7.5 mM NaNO3、HN:15 mM NaNO3，將幼苗根部放入營養液中，培養1周后取樣。不同氮源的處理：將1/2Hoagland營養液的氮源NH4NO3、Ca(NO3)2、KNO3進行更換，配置成3種相同氮素濃度但是氮源不同的培養液：(1)單一硝態氮：NaNO3；(2)單一銨態氮：(NH4)2SO4；(3)硝態氮與銨態氮的混合：NH4NO3；氮濃度均為1.5 mM。將幼苗根部放入營養液中1周后取樣。干旱脅迫：向1/2Hoagland營養液中加入不同濃度(5%，10%，15%，20%)的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG6000)，將幼苗根部放入其中處理0 h，2 h，6 h，16 h后取樣。水氮互作處理：配置10% PEG 6000 加入到含有1.5 mM NaNO3的1/2Hoagland營養液，將幼苗根部放入其中處理0h，2 h，6 h和16 h后取樣，-80℃貯存。

1.2.2草地早熟禾RNA提取及cDNA的制備 草地早熟禾總RNA的提取選用植物總RNA提取試劑盒(天根)進行，用Nanodrop 2000C和2%瓊脂糖凝膠電泳分別檢測RNA的濃度與完整性，cDNA的合成選用PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)進行。反應結束后，將cDNA，并放于-80℃長期保存備用。

1.2.3NADH-GOGAT基因克隆 草地早熟禾cDNA為模板，采用RT-PCR方法克隆獲得GOGAT基因的完整ORF序列。PCR反應總體系50 μL，在PCR管依次加入25 μL PrimeSTAR Max Premix，4 μL cDNA，4 μLNADH-GOGAT-F/R，13 μL dd H2O。PCR反應程序為98℃預變性5 min，98℃變性30 s，56℃復性30 s，72℃延伸3 min，共35個循環，最后72℃再延伸10 min。PCR產物經切膠回收、轉化、酶切鑒定后進行雙向測序。

1.2.4NADH-GOGAT基因的生物信息學分析 利用Open Reading Frame Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)查找與識別開放閱讀框并翻譯出氨基酸序列；利用DNAMAN軟件分析蛋白的理論分子量和等電點；利用SOPMA和SWISS-MODEL軟件預測蛋白二、三級結構；蛋白序列對比用Clustal W軟件執行；系統進化樹用MEGA 5.0 軟件，鄰接法繪制系統進化樹；通過Pro Param進行理化性質分析。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.5NADH-GOGAT基因的表達模式分析 本研究的qPCR采用相對定量方法[12]，EF1α為內參基因，引物見表1。反應體系為50 μL，包含25 μL TB Green Premix Ex Taq II，2 μL Q-NADH-GADPH -F/R，4 μL cDNA，17μL dd H2O。PCR反應程序為95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃復性30 s，40個循環。qPCR共3次生物學重復，3次試驗重復。用2-ΔΔCt法處理數據，分析NADH-GOGAT基因在組織部分及逆境脅迫下的表達水平。

1.3 數據處理

利用SPSS 13.0和Excel 2007軟件進行數據處理，用GraphPad Prism 7.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 植物總RNA電泳及濃度檢測

提取獲得草地早熟禾總RNA，結果顯示18S和28S有兩條明顯的核糖體帶，說明所提RNA質量良好(圖1)。用Nanodrop 2000C測定的A260/A280比值在1.8～2.0之間，提取的草地早熟禾RNA基本無酶和蛋白污染，可用于后續試驗。

圖1 草地早熟禾RNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA of Kentucky bluegrass

2.2 草地早熟禾NADH-GOGAT基因編碼區克隆

本研究以反轉錄獲得的cDNA為模板，NADH-GOGAT-F和NADH-GOGAT-R為引物進行PCR擴增，獲得大約3236bp的目的基因序列(圖2)。將目的序列回收，連接克隆載體，挑選陽性克隆測序。

圖2 NADH-GOGAT基因電泳擴增圖(M為Marker 10000，1和2均為NADH-GOGAT基因)Fig.2 PCR product of NADH-GOGAT gene in Kentucky bluegrass(M：DL 10,000 DNA Marker，1 and 2：Amplification products)

2.3 NADH-GOGAT基因的生物信息學分析

2.3.1NADH-GOGAT基因編碼氨基酸序列分析 利用ExPASy ProtParam軟件對NADH-GOGAT基因編碼的氨基酸序列進行理化性質分析。NADH-GOGAT的分子量為49.89KD，等電點(pI)為6.11，蛋白質分子式為C2223H3531N603O651S24，理論半衰期為30 h，不穩定指數27.08，脂肪指數是89.82，為穩定蛋白。NADH-GOGAT蛋白的氨基酸組成中含量較高的是亮氨酸(Leu)，占11.0%。其中，表面帶負電荷氨基酸殘基：天冬氨酸(Asp)+谷氨酸(Glu)，有62個，帶正電荷的氨基酸殘基：精氨酸(Arg)+賴氨酸(Lys)，有56個，平均親水系數為-0.233。

利用Signal P 4.1 Server進行信號肽預測分析，結果表明，NADH-GOGAT的平均信號肽最大值為0.179，未超過其閾值0.5，推斷出該蛋白沒有信號肽，屬于非分泌性蛋白。預測NADH-GOGAT編碼蛋白為非跨膜蛋白。亞細胞定位研究表明，NADH-GOGAT可能位于細胞質。利用Expasy-protscale軟件在線分析草地早熟禾NADH-GOGAT蛋白親水性。從整條多肽鏈的氨基酸預測值來看，疏水性氨基酸為178個，親水性氨基酸為259個。由此可以推斷，草地早熟禾NADH-GOGAT蛋白是一種親水性蛋白。

2.3.3蛋白結構的預測分析 SOPMA在線預測NADH-GOGAT蛋白的二級結構，結果表明，該蛋白含有43.60%的α-螺旋、34.16%的不規則卷曲、8.54%的β-轉角和13.71%的延伸鏈。進一步利用SWISS-MODEL在線軟件對NADH-GOGAT基因編碼蛋白三級結構進行建模，發現其與二級結構的預測結果一致(圖3，圖4)。

圖3 NADH-GOGAT蛋白的二級結構Fig.3 Secondary structure of NADH-GOGAT protein

圖4 NADH-GOGAT蛋白的三級結構Fig.4 Predicted tertiary structure of NADH-GOGAT protein

2.3.5NADH-GOGAT的同源性分析 利用NCBI

網站分析測序結果表明，該基因含有1條1338bp的完整編碼區，編碼1條446個氨基酸的多肽鏈。再通過NCBI網站進行Blast分析，表明NADH-GOGAT含有1個Glu-syn-central結構域，屬于Glu-syn-central超級家族，同時還存在另一個Gn-AT-Ⅱ超級家族(圖5)。利用MEGA 5軟件對多個物種中NADH-GOGAT氨基酸同源比對，繪制系統發育進化樹(圖6)。結果發現，草地早熟禾NADH-GOGAT編碼氨基酸與硬粒黑小麥(Secalecereale×Triticumturgidumsubsp.Durum)同源性最高，為97%，其次是硬質小麥(Triticumturgidum)和山羊草(Aegilopstauschiisubsp.)，均為96%。

圖5 NADH-GOGAT功能結構域CDD預測Fig.5 Prediction of NADH-GOGAT conserved domains

2.3 表達分析

2.3.1不同組織結構中NADH-GOGAT基因的表達分析 結果表明，NADH-GOGAT基因在草地早熟禾不同組織部位中其表達差異顯著。NADH-GOGAT基因在草地早熟禾葉中的相對表達量最高，是根部的14.01倍，是莖的8.52倍(圖7)。

2.3.2氮素調控中NADH-GOGAT基因的表達分析 為了更好地觀察氮素調控對NADH-GOGAT基因表達水平的影響，本研究從相同氮源不同濃度和相同濃度不同氮源的角度，測定NADH-GOGAT基因的表達調控情況。圖8可以看到，NADH-GOGAT基因隨著氮素濃度不同，其相對表達量顯著變化。NADH-GOGAT在LN組(1.5 mMNaNO3)中相對表達量最高，隨著氮素濃度增加，該基因相對表達量下降，HN組(15 mM NaNO3)為最低值。

圖6 NADH-GOGAT系統進化樹分析Fig.6 Phylogenetic tree analysis of NADH-GOGAT

圖7 不同組織部位的NADH-GOGAT基因的表達情況(P <0.05)Fig.7 Relative expression levels of NADH-GOGATgene in different tissues(P<0.05)

本研究發現，同為1.5 mM氮素濃度的不同氮源處理下，NADH-GOGAT基因表達差異顯著(圖8)。氮源僅為NaNO3處理時NADH-GOGAT基因相對表達量最高，其次是(NH4)2SO4處理，NH4NO3處理后的相對表達量最少。NH4NO3與(NH4)2SO4處理后的NADH-GOGAT基因差異不顯著。NaNO3與NH4NO3處理后的NADH-GOGAT基因差異不顯著。綜合結果，低氮濃度時，硝態氮更有利于NADH-GOGAT基因的表達。

2.3.3干旱脅迫下NADH-GOGAT基因的表達分析 從圖9可見，干旱脅迫影響草地早熟禾NADH-GOGAT基因的表達水平。10%PEG6000模擬干旱處理2 h時，NADH-GOGAT基因的相對表達量最高，隨著干旱脅迫時間的增加，表達量迅速降低，16 h的相對表達量僅為2 h的0.25倍。5%，15%，20% PEG6000處理的樣品，NADH-GOGAT基因在不同時間內的表達量均無顯著差異。

圖8 氮素調控中NADH-GOGAT基因的表達水平(A:不同氮素濃度，B:不同氮源，P<0.05)Fig.8 Relative expression levels of NADH-GOGAT gene in N management(A:nitrogen content,B:nitrogen source，P<0.05)

圖9 干旱處理NADH-GOGAT基因的表達變化(P<0.05)Fig.9 Relative expression levels of NADH-GOGAT gene under drought treatment(P<0.05)

2.3.4水氮互作調控中NADH-GOGAT基因的表達分析 圖10可見，水氮互作影響草地早熟禾NADH-GOGAT基因的表達水平。單一干旱脅迫(10% PEG6000)2 h時，NADH-GOGAT基因的表達量最高，但是水氮互作下，該基因的表達急速下降。在6 h與16 h時，均呈現水氮互作組(10%PEG6000+LN)的表達量顯著低于單一干旱處理組?？梢?，水氮互作一定程度上抑制了NADH-GOGAT基因的表達。

3 討論

氮素同化是植物生長發育的一個極其重要的生理過程。無機氮可以通過GS/GOGAT循環轉化為L-谷氨酰胺和L-谷氨酸。植物中，谷氨酸合成酶的兩種分子形式，它們在催化電子供體上不同，NADH-GOGAT (EC 1.4.1.1)和鐵氧化還原蛋白(Fd)-GOGAT (EC1.4.7.1.)。這2種亞型在分子質量、動力學、組織分布和植物氮代謝功能等方面普遍存在差異[13]。GOGAT以Fd-GOGAT和NADH-GOGAT存在于高等植物中，都位于葉綠體或質體中。NADH-GOGAT主要參與氮類化合物的轉移運輸。Fd-GOGAT[14][在光合組織的葉綠體中表現出較高的活性。本研究首次克隆獲得草地早熟禾NADH-GOGAT基因，并對其進行生物信息學分析，為后續研究其功能奠定基礎。

圖10 水氮互作時NADH-GOGAT基因的表達變化(P<0.05)Fig.10 Relative expression levels of NADH-GOGATgene in water and nitrogen interactions (P<0.05)

苜蓿[15]NADH-GOGAT蛋白質含量的變化與從衰老器官到發育器官的氮循環率的變化有關。有研究表明水稻NADH-GOGAT基因在水稻氮利用和籽粒灌漿起到重要作用[16]。NADH-GOGAT在發育器官中起到利用與運輸谷氨酰胺的作用[17]。有研究者利用QTLs方法發現水稻的NADH-GOGAT基因在葉片中作用顯著[18]。大豆(Glycinemax)的葉片中NADH-GOGAT活性最高，根部最低，這些結論與本研究結果一致。但是，海岸松(PinuspinasterAit.)[19]幼苗不同組織部位的表達分析顯示，NADH-GOGAT基因主要在非光合組織如根和莖中表達，葉中表達量較低。這可能是由于松樹為木本植物，草地早熟禾屬于草本植物，草地早熟禾的葉片占整體的部分較多，其在氮同化的作用與松樹有一定差異。

甜菜葉片中GOGAT基因的表達量隨施用氮素水平的增加而增加，但施氮過量反而限制該基因的表達，這與本研究結果相似，過高的氮濃度會抑制草地早熟禾NADH-GOGAT基因的表達。當15 mM NaNO3時，NADH-GOGAT基因的表達量比1.5 mM NaNO3處理時降低了77.27%。不同氮素形態處理的茶樹(Camelliasinensis)GOGAT活性的年動態差異不大[20]。相同氮濃度下與銨態氮相比，硝態氮更有利于甜菜GOGAT基因的表達[4]。這與本研究結果相似，與銨態氮相比，硝態氮的處理更利于草地早熟禾NADH-GOGAT的表達。藥用植物半夏(Pinelliaternata)的[21]NR、GS、GOGAT在輕度干旱和中度干旱條件下的活性高于水分充足時的活性。本研究結果與其相似，輕度干旱有利于草地早熟禾NADH-GOGAT基因的表達。葡萄(Vitisvinifera)[22]的GS和GOGAT活性隨著水分脅迫的加深其活性逐漸降低。草地早熟禾是喜水喜肥的草坪草種，水分與氮素營養對于其生長發育有一定程度的影響[23-24]。本研究發現水氮互作在一定程度上抑制草地早熟禾NADH-GOGAT基因的表達。

4 結論

本研究成功克隆得到草地早熟禾NADH-GOGAT基因，序列為3236bp，完整的ORF區為1338bp，編碼446個氨基酸。含有1個Glu-syn-central結構域，屬于Glu-syn-central超級家族。與硬粒黑小麥氨基酸序列相似度最高。亞細胞預測表明，NADH-GOGAT定位于細胞質中。草地早熟禾NADH-GOGAT基因在葉片中表達量最高。低氮且氮源為硝態氮的處理更有利于NADH-GOGAT基因的表達。NADH-GOGAT在干旱脅迫和水氮互作中表達差異顯著(P<0.05)。草地早熟禾NADH-GOGAT基因的克隆與表達分析對進一步研究該基因的功能、GS-GOGAT循環及氮代謝途徑具有重要意義。