胚挽救技術在我國無核葡萄育種中的應用及展望

趙艷卓，陳展，牛早柱，魏建國，牛帥科，楊麗麗

（河北省農林科學院石家莊果樹研究所，河北 石家莊 050061）

葡萄（Vitis vinifera）是世界四大水果之一，栽培遍及五大洲，鮮食葡萄因粒大味美而深受消費者的喜愛。無核葡萄外形美觀，品質優良，食用方便，在鮮食市場和制干領域均占據重要地位。目前，無核葡萄品種是我國各葡萄產區的主推品種[1]，其中，大部分為國外育成品種，國內育成品種較少。市售鮮食無核葡萄中大多是將有核品種經過無核化處理后得到的，如玫瑰香、巨峰、藤稔、紅地球、醉金香、陽光玫瑰等，天然無核品種只占一小部分。隨著國際果品安全進程的不斷推進，利用化學物質誘導葡萄無核化勢必要被應用綠色安全的無核品種所取代。因此，加大無核葡萄育種力度，選育大粒、優質且具香味的鮮食無核葡萄品種成為當今葡萄育種的主要目標[2，3]。

無核葡萄育種途徑有芽變選種、雜交育種、多倍體育種、胚挽救育種、分子標記輔助育種等，其中雜交育種是無核葡萄育種的主要手段。傳統的雜交方式只能以有核葡萄為母本，依靠傳遞力強的無核父本來傳遞無核性狀，利用這種方式選育無核葡萄品種效率很低，雜種后代中無核的幾率一般不超過15%[4]，且選育過程時間長。但這一狀況在1982年因Ramming等創立無核葡萄胚挽救（embryo rescue）技術而改變。胚挽救技術是運用植物組織培養技術，對假單性結實或其他發育有障礙的受精胚或胚珠，在其合子胚敗育之前進行離體培養，阻止幼胚敗育，利用胚乳及培養基中的營養使其發育成充實的胚，最終形成完整的植株[5]。該技術使無核葡萄×無核葡萄的雜交方式成為現實，是目前無核葡萄育種研究中發展最快的新興實用技術，推動了無核葡萄的育種進程。我國自20 世紀90年代開始無核葡萄胚挽救技術研究，現已在無核葡萄種質創新[4，6～15]、三倍體無核品種選育[8，10，11，16～20]、抗性品種選育[21～26]等方面廣泛應用，同時對影響胚挽救的不同因素[3，9，21，24，27～34]進行了研究。

1 胚挽救技術在無核葡萄育種中的應用

1.1 雜交育種

雜交育種是葡萄育種中使用最廣泛的技術。我國培育的葡萄品種中，約有70%是通過雜交獲得的[5，35]。與傳統育種相比，胚挽救技術因獲得的子代無核率高，且育種周期短，而被廣泛應用于葡萄無核種質的創制。通過葡萄種內雜交，或者與葡萄屬其他種間雜交，如與圓葉葡萄（V.rotundifolia）、山葡萄（V.amureusis Rupr.）、刺葡萄（V.davidii Foex.）、蘡薁葡萄（V.thunbergii Sieb.）、歐山雜種葡萄等雜交，我國葡萄科技工作者獲得了許多具有不同特性的無核葡萄新種質[7～9，24，26，36]。如，為培育無核、香味葡萄新品種，多位學者以無核葡萄品種做母本，二倍體或四倍體玫瑰香型葡萄或優系做父本，配置不同雜交組合，獲得了一批胚挽救株系[7，9，29，37，38]。

1.2 三倍體育種

目前獲得三倍體葡萄的有效途徑是二倍體與四倍體進行有性雜交，但由于染色體的不均衡性，導致胚在發育早期即發生敗育，或獲得的雜交種子生活力低，造成育種效率低下。利用胚挽救技術可阻止三倍體雜交幼胚的早期敗育，獲得三倍體植株，從而提高育種效率。李世誠等[39]較早（1998年）應用胚挽救技術得到了三倍體葡萄植株，隨后，眾多學者也通過胚挽救技術得到了三倍體葡萄，并對三倍體育種中胚挽救技術的影響因素以及三倍體植株的鑒定進行了研究[17，20，39～43]。近期，田淑芬等[29，37，38]以二倍體無核品種希姆勞特、紅寶石無核、奧迪亞無核為母本，與四倍體品種巨玫瑰雜交，并對影響胚發育及成苗的因素進行了研究，經倍性檢測獲得‘希姆勞特×巨玫瑰’的三倍體幼苗1 株。

在三倍體育種方面，多數研究是在歐亞種葡萄與歐美雜種葡萄間進行，僅有少數研究是在歐亞種與歐山雜種[19]、刺葡萄[44]間進行。唐冬梅[8]對不同倍性雜交組合后代進行分析后認為，2x×4x 雜交方式較4x×2x 雜交方式能得到更多的雜交后代，但4x×2x 雜交方式較2x×4x 雜交方式獲得的雜交后代中三倍體的比例高。

1.3 遠緣雜交育種及抗性育種

目前生產上廣泛栽培的無核葡萄品種多數屬于歐亞種，其果實品質優良，但抗病性和抗逆性較差。葡萄屬其他種則具有不同的品質特性以及優秀的抗病、抗逆性，如圓葉葡萄對根瘤蚜完全免疫，我國野生葡萄中的山葡萄具有極佳的抗寒性，但由于親緣關系較遠，造成傳統的育種方法效率低。而利用胚挽救技術可以提高培育抗病、抗逆無核葡萄新品種的效率。

在遠緣雜交方面，1988年Goldy 等首次利用胚挽救技術將歐亞種無核葡萄與圓葉葡萄遠緣雜交，探究了獲得葡萄新種質的可能性。在國內，潘學軍等[43]首次報道了利用圓葉葡萄與歐亞種葡萄雜交，成功獲得亞屬間雜種苗19 株。隨后，其他學者陸續報道了蘡薁葡萄泰山-2[23，26]，刺葡萄塘尾[23，25]、紫秋[44]、雪峰[19]，秋葡萄江西-2[23]，燕山葡萄[45]，秦嶺葡萄平利-5[45]等與歐亞種或歐美雜種葡萄進行雜交的研究。

在抗逆性方面，除少數學者采用蘡薁葡萄泰山-2、刺葡萄塘尾、秋葡萄江西-2 等，多數學者采用抗寒性極強的山葡萄如黑龍江實生、左山74-1-326、雙優等或抗寒性較強的歐山雜種北醇、北冰紅等與歐亞種葡萄雜交，以提高歐亞種葡萄的抗寒性[8，23，45～47]。應用分子輔助標記對胚挽救苗進行早期篩選，能夠大大提高育種效率。劉巧[26]和趙雅楠等[21]利用張劍俠等[48]獲得的2 個山葡萄抗寒基因連鎖RAPD 標記S241-717和S238-854 對胚挽救苗進行早期檢測，分別獲得攜帶抗寒分子標記的雜種株系55 個和15 個。

在抗病性方面，少數學者利用分子標記，如抗炭疽病基因RAPD 標記OPC15-1300，抗黑痘病基因RAPD 標記OPS03-1354，抗霜霉病基因RAPD 標記S294 和S382，抗白粉病基因標記ScORN3-R 等，對具有無核基因的胚挽救苗進行了抗病性篩選，獲得具有單抗或雙抗的無核葡萄新種質。郭海江等[49]得到擁有抗黑痘病基因的胚挽救苗9 株，擁有抗炭疽病基因的胚挽救苗1 株，同時擁有抗炭疽病和抗黑痘病基因的胚挽救苗4 株。張劍俠等[22]得到擁有抗黑痘病基因的雜種4 株。王剛[24]對篩選出的擁有抗霜霉病基因的株系接種霜霉病菌后再次篩選，得到抗病品系10 個。趙炅[25]對65 個胚挽救雜交后代株系進行抗白粉病基因檢測，但未擴增出抗白粉病標記的特異性條帶。

2 胚挽救技術在無核葡萄育種中取得的成果

我國自20 世紀90年代開始無核葡萄胚挽救研究以來，在胚挽救技術關鍵因素的優化、三倍體育種、抗性育種等方面進行了大量研究。目前，我國進行無核葡萄胚挽救育種相關研究的主要單位是西北農林科技大學王躍進團隊。該團隊自1998年起系統開展了無核葡萄胚挽救育種研究，包括對無核葡萄×無核葡萄、無核葡萄×有核葡萄的雜交組合以及無核品種自交的胚挽救操作影響條件的優化，建立了無核葡萄胚挽救技術體系；以中國野生葡萄做父本與歐亞種無核葡萄雜交，進行抗病、抗寒無核葡萄胚挽救育種，獲得了一批中國野生葡萄與歐洲葡萄雜交F1代優系，選育出大粒無核抗病優系00-3-1、大粒無核優系00-2-7 等，以及秦紅無核、秦翠無核、秦紅一號等[4]新品種。

天津師范大學/天津市農業科學院田淑芬團隊、北京市農林科學院林業果樹研究所徐海英團隊、沈陽農業大學、上海市農業科學院、新疆葡萄瓜果開發研究中心、河北省農林科學院昌黎果樹研究所等也利用胚挽救技術，在香味、抗病、抗逆無核葡萄育種方面進行了大量研究。其中，河北省農林科學院昌黎果樹研究所趙勝建團隊較早應用胚挽救技術育成了三倍體葡萄品種無核早紅[42]；上海市農業科學院蔣愛麗團隊先后育成了無核葡萄新品種滬培1 號[50]、滬培2 號[17]、申愛[51]和滬培3 號[18]。

3 無核葡萄胚挽救技術的影響因素

3.1 親本基因型

母本材料胚的可挽救性是無核葡萄雜交胚能否成功挽救的關鍵因素[4，9]。現有的研究結果表明，紅寶石無核[7，9，26，36]、火焰無核[7，23，31，36]、昆香無核[7，25，31]、奧迪亞無核[52]、京早晶、奧蘭多無核、紅臉無核、黎明無核、京早白、愛神玫瑰[23]等可挽救性比較好，適宜做母本；無核白、希姆勞特、波爾萊特、優無核、克瑞森無核等胚過早發生敗育或可挽救性差的品種不適宜做母本[31，53，54]。唐冬梅[8]對幾個無核品種胚挽救的難易程度進行了比較，結果顯示，胚挽救由易到難的品種順序為奧迪亞無核、奇妙無核、火焰無核、優無核、無核紫、皇家秋天、底來特、黎明無核、無核白、森田尼無核。田淑芬等[52]對不同品種自交胚的發育率和萌發率進行了比較，結果顯示，奧迪亞無核自交胚的發育率和萌發率最高，其次是紅寶石無核、希姆勞特，森田尼無核最低。

雜交父本對胚挽救的成功率也有影響。通常用無核性狀傳遞能力強的品種如無核白、無核黑，或起源于二者的無核品種或品系做父本，后代可分離出較高比例的無核個體[4，53]。郭雨瑞[31]進行了提高無核葡萄胚挽救育種效率的研究，結果顯示，玫瑰香和北冰紅分別與火焰無核雜交時，利用玫瑰香的挽救效果優于北冰紅；當昆香無核做母本時，北冰紅做父本的挽救效果優于泰山-2 做父本；當奇妙無核做母本時，陽光玫瑰和雙優做父本的挽救效果優于北冰紅做父本。史文靜等[7]研究指出，香味品種中玫瑰香適合作為父本進行香味無核種質的選育。牛茹萱等[47]報道，歐山雜種較山葡萄更適宜于做雜交父本。

3.2 接種時期

接種時期是影響胚挽救效果的另一關鍵因素。研究表明，在胚大量敗育前、胚發育至心形胚或更高程度時進行胚挽救對于成功挽救具有決定性影響。但迄今為止，還沒有一個普遍適用的選擇最佳接種時期的方法或指標。目前，大多數學者采用授粉后天數或盛花后天數作為接種時期的具體指標來間接反映胚珠內胚的發育程度。研究表明，不同品種和雜交組合的最佳接種時間不盡相同[7，9，10，31，54～57]（表1）。

表1 部分葡萄品種和雜交組合的最佳接種時間Table 1 Optimum inoculation time of some grape varieties and hybrid combinations （d）

相同的品種及雜交組合，因植株狀況、地理環境或者研究者取樣間隔的不同，最佳采樣時間會有所差異。田淑芬等[52]研究指出希姆勞特自交胚的最佳取樣期為授粉后54 d，而此前報道的希姆勞特自交胚最佳采樣時間為授粉后42 d[54]。紅寶石無核在南方的最佳采樣期為花后33～41 d[32]。父本基因型對雜交組合的取樣時間也有一定的影響[24]。實踐中，需針對具體的親本組合進行采樣時間的優化。

3.3 培養基

3.3.1 基礎培養基 無核葡萄的胚挽救過程分為胚珠內幼胚發育、胚萌發、胚成苗3 個階段。在胚珠培養階段應用的培養基有ER、MS、B5、White、Nitsch、NN、改良MM3、MM4 等，其中，Nitsch 培養基和ER 培 養基應 用 得 較 多[29，36，47，57，58]。但 不 同 品種或雜交組合的最適培養基不同，如，波爾萊特做母本時適合ER 培養基，紅無籽露做母本時適合MM4 培養基[47]。趙雅楠等[21]對接種于MM3 和ER基本培養基上胚珠的胚發育率和成苗率進行比較后發現，MM3培養基處理的指標值均高于ER 培養基處理。在胚萌發和成苗階段應用的培養基有Nitsch、ER、BD、1/2 MS、WPM、MM4，其中，使用較多的是1/2 MS 和WPM[7，36，37，47，59，60]。

3.3.2 外源添加物 在外植體培養中，適宜的外源激素種類及配比起著重要作用。不同葡萄品種對激素的敏感程度存在顯著差異，并且隨胚的發育程度而變化。胚發育程度越高，對激素的要求越不嚴格。多數研究者認為，培養基中添加適宜濃度的外源激素如6-BA、IAA、IBA、GA3等對胚的發育具有促進作用[3，29，30，36，54]。不同雜交組合對6-BA 的敏感程度不同，其中，應用較多的添加量為0.5 mg/L[29，30，54]。郭雨瑞[31]研究了多效唑（paclobutrazol，PAC）對胚挽救效果的影響，結果顯示，在MM3 培養基中添加1.5 mg/L 的PAC 可以提高‘火焰無核×北冰紅’、‘昆香無核×泰山-2’雜交胚珠的成胚率；在胚萌發階段，向WPM培養基中添加1 μmol/L 的PAC 可以提高‘紅無籽露×北冰紅’的發芽率和成苗率。

在葡萄生長過程中噴施植物生長調節劑也有利于胚珠的發育。唐冬梅[8]研究表明，花前兩周噴施100～500 mg/L 的矮壯素能顯著促進森田尼無核胚珠的發育，提高森田尼無核胚的萌發率和最終成苗率。李桂榮[60]發現，在無核葡萄坐果過程中噴施IAA 30 mg/L＋ABA 30 mg/L 可以促進漿果內胚珠的發育。朱佩佩[36]研究指出，花前2 周噴施30～50 mg/L 的6-BA 能夠促進雜交組合胚的發育，這與陶建敏等[61]的研究結果相一致。

添加多胺（腐胺、精胺、亞精胺）[9，60]、氨基酸（絲氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺）[3，21]、水解酪蛋白、秋水仙堿、麥芽糖、香蕉泥等，也對胚的發育起到一定的促進作用。在胚萌發培養基WPM 中添加3 mmol/L 腐胺有利于‘紅無籽露×雙優’、‘紅寶石無核×紫香無核’、‘愛神玫瑰×陽光玫瑰’成苗，成苗率分別提高了13.34%、6.67%和30.16%；添加0.5 mmol/L 亞精胺有利于‘紅寶石無核×火焰無核’、‘紅臉無核×愛神玫瑰’成苗；添加0.3 mmol/L 精胺有利于‘紅寶石無核×江西-2’、‘紅無籽露×紫香無核’成苗[9]。田淑芬等[3]研究了不同甘氨酸濃度對胚發育的影響，認為不同雜交組合使用的最佳甘氨酸濃度也不一樣，其中，‘紅寶石無核×玫瑰香優系’使用的最適濃度為4.0 mmol/L，‘希姆勞特×玫瑰香優系’使用的最適濃度為1.0 mmol/L。

3.3.3 培養基形態 胚挽救過程中培養基的形態主要有固相、液相和固液雙相3 種。其中，固液雙相培養基彌補了單相培養基的缺陷，既能增大胚珠與培養基的接觸面積，又能避免培養基因水分蒸發過度而導致的濃縮，經檢驗[32，36，55，56，60]培養效果很好。但也有研究顯示，對于胚珠較大的品種，3 種相態培養基的挽救效果差異不大[56]。

3.4 培養條件

培養時的光照、溫度、珠被處理方式等對無核葡萄胚挽救也有一定的影響。

無核葡萄胚挽救時胚珠培養過程中是否需要光照，目前研究結果不完全一致。由于胚在胚珠內的發育是不見光的，于是，唐冬梅等[56]和李桂榮[60]模擬胚在胚珠中的環境狀態，比較了暗培養和光照培養（光照與黑暗交替）對胚發育的影響，研究結果均證實暗培養有利于離體胚的發育。史文靜等[7]認為，暗培養時間在8～10 周為宜，暗培養時間過長會顯著增加畸形胚的比例。但鄭婷[32]的研究結果顯示，光照（光照與黑暗交替）培養可以促進胚的發育。李玉玲等[27]探討了不同光質（紅光、藍光、白光、暗）培養對火焰無核胚珠培養的影響，發現4 種光質處理對胚發育的影響效果差異不顯著。

對于胚培養過程中是否都需要低溫，研究者的看法也不一樣。一般認為，為打破胚的休眠，促進胚萌發，提高萌發率和培養壯苗，需對胚珠進行一定時間的4 ℃低溫處理。鄭婷[32]研究表明，低溫處理‘火焰無核×寒香蜜’胚珠10 d，可以使胚珠發育率、胚發育率和胚萌發率均達到相對較高的水平。但也有學者認為，由于無核葡萄的胚未發育成熟，其并未進入休眠狀態，因此，無需考慮休眠問題。唐冬梅等[56]和田淑芬等[52]的研究結果均表明，在胚珠離體培養階段低溫培養會抑制胚的發育，降低胚發育率。

在無核葡萄胚挽救過程中，珠被的處理方式有不處理（全胚珠）、橫切、縱切、切喙和剝取裸胚。多數學者認為，剝取裸胚可以提高胚的萌發率[62]，使胚提前萌發且成苗整齊，同時，可直接判斷胚挽救苗是來自合子胚還是來自體細胞胚。但是，由于不同的品種或雜交組合胚剝離難易程度不一樣，且在剝胚過程中容易使胚受傷而產生較多的畸形苗，故一些學者采取橫切[63]、切喙[58]的方式處理珠被，使胚在胚乳和培養基的雙重營養下萌發生長，同樣可以提高胚珠的萌發出苗率，并且操作容易，對胚的傷害小。所以，橫切和切喙的珠被處理方式也被較多學者所應用。

3.5 胚挽救苗的馴化移栽

胚挽救苗的馴化移栽是一個由半異養到自養、高濕到低濕、恒溫到變溫、無菌到有菌的過程[33，64]，是其從實驗室走向大田的關鍵步驟。李桂榮[60]建立的移栽馴化操作程序為強光閉口煉苗7～14 d—移栽至基質—罩透明塑料杯保濕煉苗—溫室馴化—移植大田。胚挽救苗的生長狀況、移栽基質和噴施營養液等是影響無核葡萄育種成苗的主要因素。

一般認為，苗齡30～40 d 是胚挽救苗移栽的適宜時期[6，8，33，64]；60 d 時的試管苗根系已經老化，移栽成活率會大大降低。但是，苗齡并不適合所有的情況，應結合要移栽馴化的胚挽救苗的長勢和高度進行綜合評判。李桂榮[60]研究認為，苗高8～10 cm 時是胚挽救苗的最適移栽時期。

單一的移栽基質成分有園土、泥炭土、蛭石、河沙、珍珠巖、椰糠等。一般認為，應用復配基質的效果優于應用單種特定的移栽基質。實踐中應用的復配基質配方有V（珍珠巖）∶V（蛭石）∶V（河沙）＝1∶1∶1[33]、V（珍珠巖）∶V（草炭）∶V（園土）＝4∶1∶1[6]、V（珍珠巖）∶V（草灰）＝1∶1[62]、V（基質土）∶V（蛭石）＝5∶1[7]、V（蛭石）∶V（泥炭土）∶V（椰糠）＝1∶4∶1[60]，V（椰糠）：V（蛭石）∶V（腐葉土）＝2∶1∶1[65]。馴化移栽時常用的營養液為B5 和MS。對營養液濃度進行比較后，多數學者認為，用1/8 MS大量元素[8，24，33，60]營養液澆灌胚挽救苗利于壯苗，有助于移栽成活率的提高；也有人認為，應用更低濃度的1/10 MS[60]或1/16 MS[6]營養液對胚挽救苗的移栽馴化有利且經濟。唐冬梅[8]用1/4 B5 大量元素溶液澆灌移栽苗，幼苗的成活和生長效果較好。

生根粉屬于生長素類的植物生長調節劑，生長素能調控側根根原基的形成，促進植物側根和不定根的發生與生長，并且側根的發生與伸長都直接或間接地依賴于生長素的調控作用[59]。用300 mg/L 生根粉浸根20～30 s[33]或用1.0 mg/L 生根粉浸根3 min[59]處理幼苗，移栽成活率較高。

4 展望

我國在葡萄育種中應用胚挽救技術已有30 余年的歷史，在無核葡萄胚挽救影響因素方面以及三倍體育種、遠緣雜交育種和抗性育種等方面進行了系列研究，建立了無核葡萄胚挽救技術體系，創制了很多無核葡萄新種質，并育成一些無核葡萄新品種。但與國外引進品種相比，我國的這些育成品種在商品性上缺乏突破；且多數品種都是由2 個外來或古老種質的簡單雜交獲得，缺少多親多代綜合雜交育成的品種[66]。這一狀況與我國擁有眾多栽培品種和豐富野生葡萄資源的事實不相符。我國野生葡萄中的一些種和株系具有較強的抗病、抗逆性，現有研究表明其基因組存在主效抗病基因，且與歐洲葡萄無核品種雜交易親和，因此，在對葡萄重要性狀的遺傳規律進行系統研究的基礎上，充分利用我國的葡萄資源，應用胚挽救技術與傳統雜交育種等手段，選育具有大粒、無核、抗性強等優良性狀的葡萄新品種仍是目前育種工作者不斷探索和研究的重點。

利用胚挽救技術得到的F1代雜種中還存在一定比例的有核雜種，尤其是利用有核葡萄做父本時。利用分子標記對F1代雜種進行無核、抗性性狀的早期篩選，能夠提高育種效率，節省大量人力、物力、財力。迄今，已有5 個無核基因分子標記被用于葡萄無核性狀的輔助選擇，分別是SCAR 標記SCC8、SCF27 和GSLP1-569，微衛星標記VMC7F2 和p3-VvAGL11[4，67]。在抗病性方面應用的分子標記有許多，如，抗炭疽病基因PAPD 標記OPC15-1300，抗黑痘病基因RAPD 標記OPS03-1354，抗霜霉病基因RAPD 標記S294 和S382，抗白粉病基因RAPD 標記OPW02-1756 等。在抗寒性方面應用的分子標記有S241-717 和S238-854。由于分子標記與目標基因的連鎖程度、適用的廣泛性等影響著輔助選擇的效率，因此，繼續尋找緊密連鎖的無核基因分子標記以及抗病和抗逆基因分子標記，仍是今后葡萄分子育種的重要內容。