益生菌VSL#3對DSS大鼠結腸炎TLR4-NF-κB通路的調節作用

張孟爽 牛敏 劉淑敏 杜娜 堯靜 陳辭言 杜艷,*

(1 中國云南省檢驗醫學重點實驗室，云南省實驗診斷研究所，昆明醫科大學第一附屬醫院醫學檢驗科，昆明 650032；2 菏澤市立醫院，菏澤，274100；3 云南省中醫醫院檢驗科，昆明 650021)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)，是一種慢性非特異性結腸炎癥，屬于炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease, IBD)的一種，在我國患病率逐年上升，其特點是反復發作，遷延不愈，導致患者生活質量較低。UC的病因及發病機制不清，腸道微生物與該病的發生發展密切相關[1-2]。UC發病機制可能為腸道菌群失調以及腸黏膜屏障功能缺陷，腸道致病菌侵入黏膜下層，激活機體免疫系統，從而導致細胞因子失衡，炎性細胞活化，使腸黏膜產生炎癥。此過程可由TLRs介導，通過下游信號傳遞分子MyD88胞內信號轉導，最終導致NF-κB激活和轉位，產生致炎因子TNF-α、IL-1β等，進一步破壞腸道免疫穩態導致UC發生。

臨床上在使用常規治療方案的同時，可輔以使用益生菌制劑，從而使UC患者腸道菌群失調程度降低，以減輕患者的炎癥反應[3]。VSL#3是一種益生菌混合物，含菌量較高，含有8種常見的人體腸道有益菌種(4種乳桿菌屬、3種雙歧桿菌屬和1種鏈球菌屬)，2009年的兩項臨床試驗的結果均顯示VSL#3對UC的誘導緩解有效[4-5]。本課題組前期研究也發現益生菌VSL#3能修復DSS誘導的結腸炎大鼠受損的結腸組織，緩解炎癥癥狀，并可有效降低結腸組織促炎因子IL-6，TNF-α的含量，提高抗炎因子TGF-β、IL-10的含量，阻斷炎癥反應，縮短炎癥持續時間。益生菌VSL#3可以降低腸道菌群失調嚴重程度，一定程度降低菌群失調率，提高雙歧桿菌、擬桿菌等益生菌的比例[6]。綜上所述，益生菌VSL#3的治療作用是否與TLR-4通路有關值得進一步探討。

為了深入研究益生菌VSL#3對UC免疫信號通路TLR4-NF-κB的免疫調節機制，本研究使用DSS構建潰瘍性結腸炎大鼠模型，然后采用real-time PCR、Western-Blot檢測結腸組織中該通路上下游因子的表達情況，同時使用ELISA檢測治療前后大鼠血清中致炎因子TNF-α、IL-1β水平的變化。

1 材料和方法

1.1 動物

健康6～7周齡雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重180～220g。實驗正式開始前7d適應環境。實驗動物倫理審批號: SCXK(滇)k2015-0002。

1.2 分組

動物模型構建：稱取DSS 50g，加入去離子水定容至1000mL，配制成5%DSS溶液，根據實際飲用量，每日新鮮配置，自由飲用一周。7d后，DSS造模組自由飲用去離子水1周，益生菌治療組使用益生菌VSL#3(菌量為105cfu/天)灌胃一周，第8天處死大鼠，收集大鼠的血清和結腸組織。具體分組情況如下：33只大鼠隨機分組，A：空白對照組(3只)；B：DSS造模組(15只)；C：益生菌VSL#3治療組(15只)。

1.3 儀器與試劑

ABI7500型定量PCR儀(美國ABI公司)，Biorad轉膜槽(美國Bio-rad公司)，紫外分光光度計(美國Thermoscientific公司)，化學發光成像儀(美國Bio-rad公司)，酶標儀(美國Bio-rad公司)。硫酸葡聚糖鈉(美國MPBIO)，益生菌VSL#3(美國Ferring Pharmaceuticals Inc)，Eastep?Super總RNA提取試劑盒、GoScript反轉錄試劑盒以及GoTaq?qPCR Master Mix均為普洛麥格(北京)生物技術有限公司，TLR4 兔抗鼠抗體(SANTA)，NF-κB p65兔抗鼠抗體(proteintech)。Rat IL-1beta ELISA Kit(聯科生物)，Rat TNF-α ELISA Kit(聯科生物)。

1.4 方法

1.4.1 疾病活動指數及組織學評分

計算疾病活動指數(DAI評分)以及組織學評分，評分標準見表1～2。體重下降=(當日體重-造模結束時體重)/ 造模結束時體重

1.4.2 實時熒光定量PCR檢測結腸組織MyD88、TNF-α、IL-1β、TLR4、NF-κBmRNA的表達

RNA的提取使用普洛麥格總RNA提取試劑盒，按照說明書進行操作。引物序列如下(表3)。

1.4.3 Western-Blot檢測結腸組織中TLR4、NF-κB p65的表達

把組織剪切成細小的碎片，使用液氮將組織充分研磨，稱取20mg組織于無菌EP管內，加入150μL RIPA裂解液(已加入PMSF)，充分裂解后，14000g離心5min，取上清，分裝，做好標記放于-80℃保存。使用BCA法測定蛋白濃度。然后制備SDS-PAGE凝膠，蛋白變性，電泳(壓縮膠80V 30min，分離膠120V 1h)，轉膜(濕轉，120V 1h, PVDF膜)，封閉，抗體孵育等，經ECL發光后，于成像系統拍照。

表1 DAI評分表Tab.1 DAI score

表2 組織學損傷評分標準Tab.2 Histology injury score

表3 引物序列Tab.3 Primer sequence

1.4.4 ELISA檢測大鼠血清中TNF-α、IL-1β蛋白的表達

分離管分離血清，取血后使血樣凝集30min，1000g離心10min。分裝，儲存于-20℃冰箱(減少凍融次數)。實驗開始前取出冷凍樣本，恢復至室溫，緩慢混勻。具體操作步驟按照試劑盒說明書進行，計算OD值，利用軟件進行回歸擬合以生成標準曲線，使用回歸分析確定最佳擬合曲線

1.4.5 統計學處理

使用IBM spss 24統計學軟件包。實驗數據采用均數±標準差(x±s)表示，組間差異比較用方差t檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 疾病活動指數及組織學評分

2.1.1 一般情況

除空白對照組外，自由飲用5%DSS的第4天，幾乎所有大鼠均出現肉眼血便，繼續飲用5%DSS至7d。從8d開始，VSL#3治療組使用益生菌VSL#3進行灌胃治療。在益生菌治療過程中，空白對照組大鼠毛色光滑，正常進食，大便成型；DSS造模組大鼠食量減少，毛色干枯無光澤，稀便，部分大鼠出現黏液膿血便或血便，肛門口可見血跡；VSL#3治療組大鼠毛色欠光滑，反應欠靈活，腹瀉或血便，但與DSS造模組相比，情況較好。經過益生菌VSL#3治療一周后，益生菌治療組DAI積分與DSS模型組相比，顯著降低(t=1.8,P=0.001)，差異具有統計學意義。

2.1.2 病理學評分

益生菌治療一周后，取大鼠結腸組織，進行蘇木素-伊紅染色(HE染色)。HE染色部分圖片如圖1所示。空白對照組大鼠結腸黏膜上皮細胞連續性完整，隱窩未破壞，腺體排列整齊，固有層無炎癥細胞浸潤；DSS造模組結腸黏膜有多處糜爛及潰瘍灶，腺體不同程度增生且排列紊亂，伴有隱窩膿腫或隱窩炎，固有層可見大量以淋巴細胞為主的炎癥細胞浸潤；VSL#3治療組腸黏膜病理學損傷均有不同程度的緩解，結腸黏膜的糜爛潰瘍灶及隱窩炎和隱窩膿腫明顯減少，病變范圍縮小，炎癥細胞浸潤亦顯著減少。對大鼠結腸組織病理切片進行組織學評分：空白對照組大鼠大腸組織學損傷評分為零，DSS造模組評分最高，為7.8±1.04。益生菌治療組評分為5.4±0.8，低于DSS造模組，差異具有統計學意義(P=0.001)。HE染色部分圖片如圖1所示。

2.2 Real-time PCR結果

與空白對照組相比，DSS造模組大鼠結腸組織TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1βmRNA的表達顯著增強(P＜0.01)，經益生菌VSL#3治療后，與DSS造模組相比益生菌治療組大鼠結腸組織TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1βmRNA的表達降低(P＜0.05)。各因子相對表達量見表4。

2.3 Western-Blot 結果

圖1 大鼠結腸組織HE染色(×400)Fig.1 Histology were observed under the microscope graph(×400)

表4 各因子3組相對表達量差異比較(x±s)Tab.4 Relative expression of each factor (x±s)

Western-blot檢測結腸組織中TLR4、NF-κB p65的表達，BCA定量，蛋白上樣量為50μg, DSS造模組TLR4、NF-κBp65蛋白的相對表達量最高，分別為0.847±0.057，1.873±0.129，與正常組相比，差異具有統計學意義(P＜0.05)。經過益生菌VSL#3治療一周后，與造模組相比，TLR4、NF-κB蛋白的相對表達量降低，差異具有統計學意義(P＜0.05)。蛋白表達情況見圖2。

2.4 ELISA結果

使用ELISA檢測大鼠血清IL-1β和TNF-α表達水平，DSS造模組血清IL-1β和TNF-α的表達最高，經益生菌VSL#3治療一周后，與DSS造模組相比益生菌治療組血清IL-1β和TNF-α的表達顯著降低(P＜0.001)。結果見表5。

圖2 各組TLR4和NF-κB p65蛋白表達情況Fig.2 Protein expression of TLR4 and NF-κB p65

3 討論

目前認為，腸道菌群的改變是誘發和維持結腸炎癥的主要原因。Macfarlane等[7]應用16S rRNA探針熒光原位雜交法研究UC患者直腸活檢標本中的菌群發現，雙歧桿菌比正常對照減少約30倍，且UC患者與正常對照中雙歧桿菌優勢菌群亦有明顯不同。本課題組前期研究也有類似發現：潰瘍性結腸炎患者腸道菌群失調率和菌群失調程度明顯高于健康對照組；益生菌優勢生長率降低，需氧和厭氧的條件致病菌優勢生長率增加[8]。從大量的臨床和基礎研究結果我們可以發現，益生菌可以通過調節失衡的腸道菌群，發揮其對潰瘍性結腸炎的治療作用。本研究中，經過益生菌VSL#3治療一周后，治療組大鼠腹瀉、血便等癥狀減輕，體重下降幅度降低，DAI評分明顯降低，腸黏膜缺失減少，固有層炎癥細胞浸潤減少等，說明益生菌VSL#3對DSS誘導的結腸炎大鼠有治療效果。

表5 大鼠血清TNF-α、IL-1β的表達水平(pg/mL)Tab.5 Expression of TNF-α and IL-1β protein in rat serum (pg/mL)

TLR屬于I型跨膜蛋白受體，目前發現的TLR有13種，其中TLR-4主要識別革蘭陰性菌的脂多糖(LPS)[9]。NF-κB是一種核轉錄因子，與免疫和炎癥反應、 細胞生長、病毒感染等密切相關。NF-κB在細胞質中與它的抑制因子I-κB結合，以不活動的狀態存在，當細胞受到刺激時，NF-κB的抑制因子I-κB磷酸化，將NF-κB從I-κB復合物中釋放出來，釋放出來的NF-κB從細胞質進入細胞核中，與特異性的結合位點結合，調控其靶基因的轉錄。腸道菌群失調以及腸黏膜屏障功能缺陷，使腸道致病菌侵襲黏膜下層，在各種微生物抗原刺激下，激活體內免疫系統，細胞因子釋放失衡，活化各種炎癥細胞致腸黏膜組織產生炎癥反應。該過程可由TLRs介導，通過下游信號傳遞分子MyD88胞內信號轉導，最終導致NF-κB激活和轉位，產生致炎因子TNF-α、IL-1β等，進一步破壞腸道免疫穩態導致UC發生。何斌等[10]研究發現，UC患者外周血中單核細胞中TLR4和NF-κB呈高表達狀態，且TLR4的表達與NF-κB的表達密切相關。

空白對照組大鼠結腸組織TLR4 、NF-κB、TNF-α、IL-1β mRNA僅有少量表達，血清TNF-α、IL-1β水平較低，DSS造模成功后，大鼠結腸組織中TLR4、NF-κB等分子在mRNA水平的表達明顯升高，同時ELISA結果顯示血清中釋放的TNF-α、IL-1β水平顯著升高，證明DSS誘導結腸炎形成的過程中，TLR4信號通路被激活，從而引起該通路下游因子TNF-α、IL-1β和炎性介質大量釋放，導致結腸組織損傷，結腸炎形成。經灌胃給予益生菌VSL#3治療1周后，大鼠結腸組織TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1βmRNA的表達降低，同時血清中TNF-α、IL-1β的水平也顯著降低。該結果提示益生菌VSL#3可抑制TLR4-NF-κB信號通路基因的激活，使其下游細胞因子和炎癥介質釋放減少，減輕結腸炎癥損傷，從而發揮其對潰瘍性結腸炎的治療作用。