圣科健骨膠囊對大鼠血清差異蛋白的影響

幺寶金， 果淑鳳， 袁勁松， 劉 佳， 趙大慶?

（1. 長春中醫藥大學， 吉林省人參科學研究院， 吉林 長春 130117； 2. 北京世紀圣科科技發展有限公司，北京 100010； 3. 長春中醫藥大學藥學院， 吉林 長春 130117）

圣科健骨膠囊是由中國預防醫學科學院和中國疾病預防控制中心專家結合國際上防治骨質疏松癥的最新科研成果研制而成的保健產品， 作為健骨類產品在市場上銷售多年， 取得了良好療效， 該制劑從骨代謝本質入手， 遵循“補骨、 修骨和養骨”三位一體理論， 將國際公認的高效健骨因子與納米鈣、 活化維生素D3、 微量元素等多種骨營養素按照一定比例復合而成， 通過調節內分泌可有效促進骨基質生成， 達到補充骨量、 修復損傷骨組織、 養護骨骼的功效。 本實驗采用同位素標記蛋白質定性定量（iTRAQ） 分析技術結合生物信息學分析方法， 對圣科健骨膠囊給藥后大鼠血清蛋白組進行差異表達分析， 以期揭示其健骨功效的內在分子機制。

1 材料

清潔級雌性SD 大鼠40 只， 體質量（220±20） g，購于長春市億斯實驗動物技術有限公司， 實驗動物生產許可證號SCXK （吉） -2016-0003。 圣科健骨膠囊由北京世紀圣科科技發展有限公司提供， 主要由高效健骨因子與納米鈣、 活化維生素D3、 微量元素等多種骨營養素按照一定比例復合而成。 ProteoMiner 低豐度蛋白富集試劑盒購于美國Bio-Rad公司； iTRAQ 蛋白標記試劑盒購于美國AB Sciex公司。 二硫蘇糖醇、 碘乙酰胺、 三乙基碳酸氫銨、胰蛋白酶等為分析純， 購于美國Sigma 公司。 乙腈、 甲醇為色譜純， 購于美國Thermo 公司； 其他試劑均為國產分析純。

2 方法

2.1 蛋白提取制備

2.1.1 給藥及血清采集 將大鼠隨機分為空白組和給藥組， 每組20 只， 給藥組給予1 g／kg 圣科健骨膠囊生理鹽水混懸液， 空白組給予等體積生理鹽水， 每天灌胃給藥1 次， 連續3 周。 末次灌胃給藥次日， 大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液麻醉， 頸總動脈收集血液， 4 ℃靜置2 h， 2 000×g 離心5 min， 收集上清液， 10 000×g 離心10 min， 收集血清， 血清組分保存于-80 ℃下。

2.1.2 蛋白富集及酶解 將空白組、 給藥組血清分別合并， 經ProteoMiner 低豐度蛋白富集試劑盒去除免疫球蛋白和白蛋白等高豐度蛋白， 采用Bradford 法測定蛋白濃度。 取2 組血清蛋白各100 μg， 加入10 mmol／L 二硫蘇糖醇， 37 ℃下還原處理1 h 后加入20 mmol／L 碘乙酰胺烷化處理45 min， 再加入5 μg 胰蛋白酶， 37 ℃下酶解4 h后再補加5 μg 繼續酶解8 h， 凍干。

2.1.3 蛋白酶解、 標記和純化 將酶解蛋白凍干粉溶于0.5 mol／L 三乙基碳酸氫銨中， iTRAQ 蛋白標記試劑盒進行酶解蛋白標記， 島津LC-20AB 液相系統進行肽段分離。 分析采用Ultremex SCX 層析柱（美國Phenomenex 公司）； 洗脫液Buffer A，pH 2.7， 含25 mmol／L 磷酸二氫鉀和25% 乙腈；Buffer B， pH 2.7， 含25 mmol／L 磷 酸 二 氫 鉀、1 mol／L氯化鉀和25% 乙腈， 洗脫條件為Buffer A 10 min， 5% ～35% Buffer B 11 min， 35% ～80%Buffer B 1 min； 吸收波長214 nm。 收集不同組分，經Strata X 層析柱除鹽后凍干。

2.1.4 液質鑒定及生物信息學分析 通過超高液相色譜nanoACQUITY 聯合質譜TripleTOF 5600 技術進行肽段鑒定， 采用Symmetry C18、 BEH130 C18色譜柱（美國Waters 公司）； 流動相A 液為水-乙腈-甲酸 （98 ∶ 2 ∶ 0.1）， B 液 為 水-乙 腈-甲 酸（2 ∶98 ∶0.1）； 洗脫條件為A 液15 min， 5%B 液1 min， 5% ～35% B 液40 min， 35% ～80% B 液5 min， 80%B 液5 min； 質譜參數反射掃描， 分辨率3.0×104以上； 脈沖頻率11 kHz； 碰撞能量（35±5 eV）。 然后， 通過ProteinPilot 5.0 軟件（美國AB Sciex 公司） 進行數據分析， 蛋白鑒定錯誤率FDR≤1%， 當2 組樣品蛋白質豐度差異倍數≥1.5 倍或≤0.67 倍， 且P＜0.05 時可認定為差異蛋白， 其功能富集采用AmiGO 進行分析。

3 結果

3.1 血清差異蛋白功能富集分析 共鑒定出237 種表達蛋白， 與空白組比較， 給藥組顯著上調的差異蛋白（差異倍數≥1.5 倍， P＜0.05） 有130 種， 顯著下調的（差異倍數≤0.67 倍， P ＜0.05） 有107種。 針對這些差異蛋白， 首先進行功能富集分析，包括細胞組分、 分子功能、 生物進程3 種功能分類。

在細胞組分功能分類中， 差異蛋白主要歸類為細胞外區域、 皮質肌動蛋白細胞骨架、 蛋白酶體核心復合物、 肌動蛋白絲、 肌動球蛋白等， 具體見表1。

表1 血清差異蛋白細胞組分富集分析（P＜0.05）Tab.1 Cellular component enrichment analysis of serum differential proteins （P＜0.05）

在分子功能分類中， 差異蛋白主要歸類為肽酶調節劑活性、 抗原結合、 肽酶抑制劑活性、 酶抑制劑活性、 過氧化物酶活性、 絲氨酸型肽鏈內切酶抑制劑活性等， 具體見表2。

在生物進程分類中， 差異蛋白主要歸類為蛋白水解調節、 外源刺激反應調節、 壓力反應調節、 大分子復合物亞基組織、 肽鏈內切酶活性調節、 肽酶活性調節等， 具體見表3。

3.2 含藥血清健骨功效分子機制研究 基于“3.1” 項下結果， 對給藥后大鼠血清中顯著上調（差異倍數≥1.5 倍， P＜0.05） 的差異蛋白作進一步分析， 結果共篩選出14 種調控骨形成及骨質密度的功能蛋白， 具體見表4， 主要包括Greb1 蛋白（Greb1）、 絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶D3 （Prkd3）、張力蛋白 （Tns4）、 絲氨酸蛋白酶抑制劑A3M（Serpina3m）、 微管相關蛋白1 A （Map1a） 等。

表2 血清差異蛋白分子功能富集分析（P＜0.05）Tab.2 Molecular function enrichment analysis of serum differential proteins （P＜0.05）

3.3 含藥血清抗炎功效分子機制研究 基于“3.1” 項下結果， 對給藥后大鼠血清中顯著下調（差異倍數≤0.67 倍， P＜0.05） 的差異蛋白作進一步分析， 結果共篩選出12 種參與炎性反應的功能蛋白， 具體見表5， 主要包括鋅指同源蛋白2（Zfhx2）、 NF-kappa-B 抑制劑zeta （Nfkbiz）、 激肽原-1 （Kng1）、 絲氨酸蛋白酶hepsin （Hpn） 等。

4 討論

本實驗采用iTRAQ 分析技術結合生物信息學分析方法， 對圣科健骨膠囊給藥后大鼠血清蛋白組進行系統分析， 共鑒定出237 種差異蛋白。 功能富集分析結果表明， 這些差異蛋白主要為細胞外基質、 細胞骨架蛋白、 蛋白酶體復合物等， 主要參與酶調節、 抗原結合、 蛋白水解調節、 外源刺激反應調節、 壓力反應調節、 大分子復合物亞基組織、 肽酶活性調節等生物進程。

表3 血清差異蛋白生物進程富集分析（P＜0.05）Tab.3 Biological process enrichment analysis of serum differential proteins （P＜0.05）

表4 含藥血清健骨功效差異蛋白分析Tab.4 Differential protein analysis of medicated serum for bone-invigorating effect

表5 含藥血清抗炎功效差異蛋白分析Tab.5 Differential protein analysis of medicated serum for anti-inflammatory effect

與空白組比較， 圣科健骨膠囊組顯著上調的差異蛋白主要包括Greb1、 Prkd3、 Tns4、 Serpina3m等調控骨形成及骨質密度的功能蛋白。 其中，Greb1 作為雌激素調節通路的重要分子， 在成骨細胞和成軟骨細胞中表達量顯著上調， 其遺傳變異與骨密度變化導致的骨質疏松密切相關[1-2］； Prkd3屬于絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶家族成員， 是成骨細胞分化和礦化結節形成的重要調控因子[3］； Tns4屬于支架蛋白家族成員， 是細胞生長和遷移的重要調控因子， 主要通過觸發整聯蛋白與肌動蛋白細胞骨 架 的 解 偶 聯 來 實 現[4］； Serpina3m、 Serpina3l、Serpina3k 同屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑Serpina3 亞型， 可通過抑制局部絲氨酸蛋白酶濃度進而調控骨髓造血微環境的動態平衡[5］； Map1a 屬于微管相關蛋白家族成員， 可通過調節微管組裝、 微管結構及功能促進成骨細胞增殖和分化[6］； Prdx2 主要在骨髓基質細胞中表達， 可有效阻止骨髓老化[7］； Prl是一種蛋白質激素， 可減少破骨細胞形成和骨質流失， 促進骨形成[8］； Gpx1 是一種抗氧化酶， 主要調控細胞防御氧化損傷， 從而防止骨質疏松癥等與年齡相關疾病的發生[9］； Epb41 最初被認為是紅細胞膜分子， 主要負責維護細胞的完整性及膜骨架和跨膜蛋白之間的相互作用， 最近研究表明， 該基因缺失小鼠腸鈣吸收功能受損， 進而導致繼發性甲狀旁腺功能亢進所致的骨鈣缺失[10］； 另外， 顯著上調的差異表達蛋白還包括具有抗炎、 抗感染、 排毒功效的功能蛋白， 如Ngp、 Cfp、 Ces1c 等[11-13］。 由此表明， 圣科健骨膠囊的健骨功效主要是通過上調以上參與調控骨密度和骨形成過程的功能蛋白來實現的。

與空白組比較， 圣科健骨膠囊組顯著下調的差異 蛋 白 主 要 包 括 Zfhx2、 Nfkbiz、 Kng1、 Hpn、Prkcsh 等參與骨關節炎和風濕性關節炎炎性反應的相關因子。 其中， Kng1 是一種高分子量激肽原，該基因缺失小鼠可有效拮抗PG-PS 所致骨關節炎炎性反應及軟骨損傷[14］； Hpn 是一種絲氨酸蛋白酶， 大量研究表明蛋白水解級聯中的絲氨酸蛋白酶導致細胞外基質如骨關節炎軟骨組織的病理性損傷[15］； Pcsk9 是一種促炎因子， 其基因缺失小鼠可有效降低炎性反應相關因子表達[16］； Cd5l、 Fcn2、Xpnpep2、 Ganab 等在骨關節炎和風濕性關節炎患者關節液或關節軟骨中表達量顯著上調[17-20］；DKK3 缺失可抑制NF-κB 信號通路， 進而降低炎性反應癥狀[21］； Nfkbiz 為非典型IκB 蛋白家族成員，也為各種炎癥刺激誘導下NF-κB 的主要反應因子，既是促炎因子， 又是抗炎基因產物活性的調控因子[22］； Zfhx2、 Prkcsh、 Napsa 等在炎性反應調控中發揮重要作用[23］。 由此表明， 圣科健骨膠囊可通過抑制相關炎性因子表達來對骨關節炎和風濕性關節炎實現防治作用。