上調(diào)PHLPP1表達(dá)對食管癌細(xì)胞增殖、黏附、侵襲和遷移能力的影響

劉一博, 張西亮, 劉 涵, 杜芮嫻

1)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系 河南新鄉(xiāng) 453000 2)商丘市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科 河南商丘 476000 3)商丘市第一人民醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科 河南商丘 476000

食管癌的發(fā)生與多種基因的調(diào)控有關(guān)。PHLPP1是美國加州大學(xué)圣地亞哥分校醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)的科研人員發(fā)現(xiàn)的，其在人類細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核上均有表達(dá)，在人體內(nèi)不同組織中的表達(dá)程度不同，調(diào)控細(xì)胞的增殖過程[1-2]，參與腫瘤、心力衰竭等疾病的發(fā)生[3-4]。目前在肺癌、胃癌、前列腺癌等多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)PHLPP1表達(dá)下調(diào)甚至缺失，推測其可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[5-7]。有研究[8]發(fā)現(xiàn)上調(diào)PHLPP1的表達(dá)可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力。本實(shí)驗(yàn)檢測PHLPP1在食管癌細(xì)胞和正常食管上皮細(xì)胞中的表達(dá)水平，探討上調(diào)PHLPP1表達(dá)對食管癌細(xì)胞增殖、侵襲等生物學(xué)特性的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與試劑人食管癌細(xì)胞Eca109、EC9706、KYSE510和人正常食管上皮細(xì)胞HEEC均購自美國ATCC細(xì)胞庫，用含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)。PHLPP1抗體購自英國Biorbyt公司；過表達(dá)PHLPP1的重組慢病毒和陰性對照慢病毒均購自北京百奧川生物科技有限責(zé)任公司；基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)1抗體、神經(jīng)性鈣黏附素(N-cadherin)抗體、上皮性鈣黏附素(E-cadherin)抗體購自美國Santa Cruz公司；MMP9抗體、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)抗體購自美國Proteintech公司。qRT-PCR和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司。

1.2qRT-PCR檢測食管癌細(xì)胞中PHLPP1mRNA的表達(dá)取Eca109、EC9706、KYSE510和HEEC，PBS洗滌。Trizol提取細(xì)胞總RNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為：2 μL總RNA、1.2 μL反轉(zhuǎn)錄引物、0.2 μL的MMLV反轉(zhuǎn)錄酶，添加RNase Free ddH2O至20 μL。反轉(zhuǎn)錄條件為：42 ℃ 30 min，85 ℃ 10 min。PCR反應(yīng)體系為：10 μL的2×定量PCR Master Mix、0.08 μL上、下游引物(20 μmol/L)、2 μL的cDNA模板、0.4 μL的Taq DNA聚合酶，加ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min ，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 12 s，62 ℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)。引物序列如下：GAPDH上游：5’-CAGAACATCATCCCTGCCTC TAC-3’， 下游：5’-TTGAAGTCAGAGGAGACCAC CTG-3’。 PHLPP1上游：5’-AAGCCAGACTTACTA CATTTGC-3’，下游5’-TCATTGAAAGAAAGACCCA GA-3’。按照2-ΔΔCt法計(jì)算PHLPP1 mRNA的表達(dá)。

1.3Western blot檢測食管癌細(xì)胞中PHLPP1蛋白的表達(dá)收集Eca109、EC9706、KYSE510和HEEC，用冰預(yù)冷的PBS洗滌，添加細(xì)胞裂解液，吹打混勻，4 ℃高速離心，吸取上清，經(jīng)BCA法定量以后，取適量的總蛋白加入到5×SDS上樣緩沖液中煮沸變性。以100 g/L的分離膠和50 g/L的濃縮膠進(jìn)行電泳，每孔上樣30 μg蛋白樣品。把凝膠放在轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10 min，NC膜裁剪成與凝膠大小相同之后放入轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡25 min，以100 V的電壓轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將NC膜放在50 g/L脫脂奶粉中孵育90 min，再將膜浸泡至PHLPP1抗體(1∶800稀釋)中室溫反應(yīng)90 min，加二抗(1∶3 000稀釋)室溫反應(yīng)2 h后，用ECL發(fā)光，以Image J分析。以PHLPP1與GAPDH(內(nèi)參)條帶灰度值的比值作為PHLPP1蛋白的相對表達(dá)水平。

1.4上調(diào)PHLPP1對Eca109細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組 取Eca109細(xì)胞，常規(guī)方法種植到6孔板內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)40%時(shí)進(jìn)行慢病毒感染，感染復(fù)數(shù)為30，在細(xì)胞中添加10 mg/L polybrene以提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。感染24 h后更換新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3 d，嘌呤霉素篩選5 d。以穩(wěn)定感染過表達(dá)PHLPP1重組慢病毒的Eca109細(xì)胞為Lv-PHLPP1組，以穩(wěn)定感染陰性對照慢病毒的Eca109細(xì)胞為Lv-NC組，以未行慢病毒感染的Eca109細(xì)胞為對照組。用qRT-PCR和Western blot檢測3組細(xì)胞中PHLPP1表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.2 MTT檢測細(xì)胞增殖和黏附情況 細(xì)胞增殖：將3組細(xì)胞接種到96孔板中，每組3孔，每孔3×103個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)24 h后，添加MTT溶液(每孔添加20 μL)孵育4 h，然后添加DMSO，檢測492 nm的A值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=Lv組或Lv-PHLPP1組A值/對照組A值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

細(xì)胞黏附：96孔板中添加纖維連接蛋白，置于超凈工作臺中風(fēng)干以后，每孔添加20 g/L牛血清白蛋白37 ℃孵育1 h，PBS洗滌。將3組細(xì)胞接種到96孔板中，每組3孔，孵育120 min，用PBS洗掉未黏附的細(xì)胞。按照上述MTT方法檢測492 nm的A值，計(jì)算細(xì)胞黏附率。細(xì)胞黏附率=Lv組或Lv-PHLPP1組A值/對照組A值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.3 Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲和遷移 用基質(zhì)膠包被Transwell小室，37 ℃孵育3 h，添加不含血清的培養(yǎng)液繼續(xù)孵育40 min。在Transwell小室的上室中分別添加3組細(xì)胞懸液各200 μL(以不含血清的培養(yǎng)液配制，細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/mL)，下室中加入500 μL含有血清的培養(yǎng)液。24 h后，取出Transwell小室，用棉簽擦掉沒有穿膜的細(xì)胞，用PBS洗2次，多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下選5個(gè)視野觀察，記錄侵襲細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)前不用基質(zhì)膠濕化，其余同侵襲實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.4 Western blot檢測細(xì)胞中PCNA、MMP1、MMP9、N-cadherin、E-cadherin蛋白水平 取3組細(xì)胞，用Western blot法檢測細(xì)胞中PCNA(抗體以1∶1 000稀釋)、MMP1(抗體以1∶600稀釋)、MMP9(抗體以1∶600稀釋)、N-cadherin(抗體以1∶600稀釋)、E-cadherin(抗體以1∶600稀釋)蛋白水平，步驟同1.3。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0分析。各組PHLPP1 mRNA和蛋白、存活率、黏附率、侵襲細(xì)胞數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)以及PCNA、MMP1、MMP9、N-cadherin、E-cadherin蛋白水平的比較均采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1PHLPP1在食管癌細(xì)胞和正常食管上皮細(xì)胞中的表達(dá)見圖1和表1。人食管癌細(xì)胞Eca109、EC9706、KYSE510中PHLPP1 mRNA和蛋白水平均低于人正常食管上皮細(xì)胞HEEC，且Eca109中表達(dá)最低。選用Eca109細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1～4：分別為HEEC、EC9706、KYSE510和Eca109

細(xì)胞PHLPP1 mRNAPHLPP1蛋白HEEC41.25±0.780.86±0.09EC970625.16±2.79?0.45±0.02?KYSE51012.38±1.36?#0.23±0.04?#Eca1095.36±0.58?#△0.04±0.03?#△F313.286135.455P<0.001<0.001

*：與HEEC比較，P<0.05；#：與EC9706比較，P<0.05；△：與KYSE510比較，P<0.05

2.23組細(xì)胞中PHLPP1表達(dá)的比較見圖2和表2。Lv-PHLPP1組細(xì)胞中PHLPP1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著高于對照組和Lv-NC組，提示高表達(dá)PHLPP1的食管癌細(xì)胞株構(gòu)建成功。

1～3：分別為對照組、Lv-NC組、Lv-PHLPP1組

組別PHLPP1 mRNAPHLPP1蛋白對照組5.32±0.060.11±0.03Lv-NC組5.37±0.080.13±0.06Lv-PHLPP1組14.31±1.26?0.34±0.03?F126.00427.056P<0.001<0.001

*：與對照組和Lv-NC組比較，P<0.05

2.33組細(xì)胞增殖、黏附、侵襲和遷移能力比較結(jié)果見表3。Lv-PHLPP1組細(xì)胞存活率、黏附率、侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)均降低。

表3 3組細(xì)胞存活率、黏附率、侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)的比較(n=3)

*：與對照組和Lv-NC組比較，P<0.05

2.43組細(xì)胞中PCNA、MMP1、MMP9、N-cadherin、E-cadherin蛋白表達(dá)的比較結(jié)果見圖3和表4。Lv-PHLPP1組細(xì)胞中PCNA、MMP1、MMP9、N-cadherin蛋白表達(dá)均降低，E-cadherin蛋白表達(dá)升高。

1～3：分別為對照組、Lv-NC組、Lv-PHLPP1組

組別PCNAMMP1MMP9N-cadherinE-cadherin對照組0.35±0.050.71±0.060.78±0.080.86±0.070.65±0.07Lv-NC組0.33±0.060.73±0.090.76±0.060.89±0.090.63±0.08Lv-PHLPP1組0.18±0.03?0.26±0.04?0.29±0.05?0.53±0.06?0.95±0.09?F11.10047.79755.36821.63314.907P0.010<0.001<0.0010.0020.005

*：與對照組和Lv-NC組比較，P<0.05

3 討論

PHLPP是一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白酶家族，該蛋白家族在腫瘤中發(fā)揮抑制作用，有兩個(gè)亞型，其中PHLPP1基因位于18q21.33染色體上，具有高度保守性，其編碼的蛋白質(zhì)可以將核糖體蛋白S6激酶、蛋白激酶C等蛋白酶去磷酸化，從而調(diào)控這些蛋白酶的活性，影響細(xì)胞的多種生理和病理功能[9]。PHLPP1在乳腺、前列腺、咽喉等多種組織中均有不同程度的表達(dá)[10]。近年來的研究[11]顯示，PHLPP1可以作為一種腫瘤抑制基因阻礙腫瘤的發(fā)展。在下咽鱗狀細(xì)胞癌、白血病細(xì)胞中的研究[12-13]顯示，PHLPP1過表達(dá)可以降低腫瘤細(xì)胞的增殖能力。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，PHLPP1在食管癌細(xì)胞Eca109、EC9706、KYSE510中的表達(dá)水平均低于人正常食管上皮細(xì)胞HEEC，并且上調(diào)PHLPP1表達(dá)可以降低食管癌細(xì)胞的存活，提示PHLPP1具有抑制食管癌細(xì)胞生長的作用。

腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤致死的重要原因。腫瘤細(xì)胞通過分泌基質(zhì)降解酶破壞細(xì)胞外基質(zhì)的完整結(jié)構(gòu)，可從缺損的細(xì)胞外基質(zhì)處進(jìn)入血管，發(fā)生轉(zhuǎn)移[14]。MMP因需要Ca、Zn等金屬離子輔助而得名，是一個(gè)含有超過20個(gè)蛋白成員的龐大家族。MMP9是一種Ⅳ型膠原酶，是目前為止研究最為深入的基質(zhì)金屬蛋白酶，在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮“鉆頭”作用。MMP1是一種間質(zhì)膠原酶，在腫瘤組織中高表達(dá)，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[15-17]。本研究結(jié)果顯示，上調(diào)PHLPP1后食管癌細(xì)胞中MMP9、MMP1蛋白表達(dá)減少，細(xì)胞的黏附、侵襲、遷移能力降低，說明上調(diào)PHLPP1可以抑制食管癌細(xì)胞降解細(xì)胞外基質(zhì)，降低食管癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能。

人類有90%的惡性腫瘤起源于上皮組織，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中常常表現(xiàn)為上皮細(xì)胞極性消失和間質(zhì)細(xì)胞特性的出現(xiàn)。腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤轉(zhuǎn)移的早期標(biāo)志之一，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生時(shí)，上皮標(biāo)記物E-cadherin表達(dá)下調(diào)，而N-cadherin表達(dá)升高[18-20]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，上調(diào)PHLPP1后食管癌細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)水平升高，而N-cadherin蛋白表達(dá)水平降低，提示上調(diào)PHLPP1可以抑制食管癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

綜上所述，PHLPP1在人食管癌上皮細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)PHLPP1表達(dá)可以抑制食管癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制MMP的合成，降低食管癌細(xì)胞的黏附、侵襲和遷移能力。本實(shí)驗(yàn)只在一株食管癌細(xì)胞中進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)，后續(xù)會在多株食管癌細(xì)胞及體內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證。