上調THBS1蛋白的表達對肺腺癌H1975細胞遷移能力的影響

刁長英，王曉慧，謝藝林，劉亞清， 高獻爭， 李晟磊

1)鄭州大學第一附屬醫院病理科 鄭州450052 2)鄭州大學基礎醫學院病理學系 鄭州450001

血小板凝血酶蛋白(thrombospondin，THBS)家族是最初發現于血小板中的一種糖蛋白，是組織發生和重塑期間調節細胞表型和細胞外結構的同源蛋白家族。 THBS1則是第一個被鑒定的成員[1]。THBS1可由多種細胞合成分泌到細胞外基質。目前有研究[2-4]表明THBS1在皮膚黑色素瘤細胞、口腔鱗狀細胞癌細胞侵襲和遷移中起作用。為進一步探討THBS1與肺腺癌H1975細胞體外遷移能力的關系，本研究采用細胞劃痕實驗檢測上調THBS1后H1975細胞遷移能力的變化及與細胞遷移相關的指標基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2和MMP-9的表達情況，以期尋找肺腺癌浸潤、轉移機制中的分子靶點。

1 材料與方法

1.1材料H1975細胞購自美國ATCC公司，RPMI 1640和胎牛血清購自美國Gibco公司，蛋白裂解液購自寶生物工程(大連)有限公司，MMP-2、MMP-9和β-actin抗體均購自美國Santa Cruz公司，增強型ECL化學發光試劑盒購自南京諾唯贊公司，PVDF膜購自上海麗臣生物科技有限公司，pcDNA3.1購自美國Invitrogen公司，pcDNA3.1-THBS1為本實驗室構建保存，熒光定量試劑盒[SYBR PremixEx Taq Ⅱ(Tli RnaseH Plus)]購自日本TaKaRa公司，cDNA合成試劑盒(ReverTra Ace QPCR RT Master mix)購自日本TOYOBO公司，引物由上海生工生物工程科技有限公司合成。

1.2細胞培養與分組H1975細胞培養于含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中。細胞分為3組，空白對照組不處理，空載體轉染組及pcDNA-THBS1轉染組分別用脂質體2000轉染空載體pcDNA3.1和pcDNA3.1-THBS1真核表達載體。

1.3細胞遷移能力檢測采用劃痕實驗。用記號筆在6孔細胞培養板背后均勻地劃出橫線，間隔0.5 cm，并使橫線橫穿過孔，保證每孔至少穿過5條線。培養板中每孔接種約5×105個細胞，第2天用槍頭劃痕，槍頭確保垂直，之后用PBS漂洗3次，加入無血清培養基。培養板放入37 ℃、體積分數5% CO2的培養箱中培養，分別于培養0、48 h拍照，根據劃痕寬度評估細胞遷移能力。實驗重復3次。

1.4MMP-2和MMP-9mRNA表達的檢測采用qRT-PCR檢測。轉染72 h收集3組細胞，PBS洗滌2～3次，按Trizol說明書提取細胞總RNA，微量紫外分光光度計測量RNA濃度，并判定純度。按照cDNA合成試劑盒說明將RNA反轉錄為cDNA，按照熒光定量PCR試劑盒說明進行DNA擴增。引物：MMP-2上游引物5’-TCGCCCATCATCAAGTTC CC-3’，下游引物5’-TCTGGGGCAGTCCAAAGAAC-3’，產物大小163 bp；MMP-9上游引物5’-CCT GGGCAGATTCCAAACCT-3’，下游引物5’-GTA CACGCGAGTGAAGGTGA-3’，產物大小172 bp。PCR擴增體系20 μL，其中Mix 10 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，雙蒸水8 μL，cDNA 1 μL。反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，84 ℃15 s，35個循環，最后7 ℃延伸7 min。反應結束后確認擴增曲線和溶解曲線等，并按照試劑盒說明書判讀結果。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。實驗重復3次。

1.5MMP-2和MMP-9蛋白表達的檢測采用Western blot法。轉染72 h后收集3組細胞，加入細胞裂解液，提取細胞總蛋白，制備SDS-PAGE凝膠，經電泳、轉膜、封閉，分別加入MMP-2和MMP-9抗體(均按1∶200稀釋)，室溫孵育2 h，加二抗反應1 h，ECL顯色后放入AI600系統檢測儀曝光并照相。以β-actin為內參，以目的蛋白和內參條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達水平。實驗重復3次。

1.6統計學處理采用SPSS 17.0處理數據，采用單因素方差分析比較3組細胞MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白表達水平的差異，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.13組細胞遷移能力的比較與空白對照組和空載體轉染組相比，pcDNA-THBS1轉染組H1975細胞的遷移能力增強(圖1)。

A、B、C：分別為空白對照組、空載體轉染組、pcDNA-THBS1轉染組；1：0 h;2：48 h

2.23組細胞MMP-2和MMP-9mRNA和蛋白表達水平的比較與空白對照組和空載體轉染組相比，pcDNA-THBS1轉染組中MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白的表達水平升高(圖2，表1、2)。

1～3：分別為空白對照組、空載體轉染組、pcDNA-THBS1轉染組

圖2 3組細胞MMP-2和MMP-9蛋白的表達

*：與其他2組相比，P<0.05

表2 3組細胞MMP-2和MMP-9蛋白表達水平的比較

*：與其他2組相比，P<0.05

3 討論

目前，化療、手術和放療是治療肺癌的主要方法，約3/4的患者就診時已處于晚期，無法手術，只能選擇化療[5]。然而，大多數常規劑型的化療藥物是全身分布的，治療肺癌可能無效，并且會產生嚴重的副作用[6]。因此，靶向藥物已經被認為是治療肺癌的理想策略。

近年來，越來越多的研究[2,7-9]表明，THBS1是多種癌癥預后差和復發的一個指標，如神經膠質瘤、黑素瘤、卵巢癌及胰腺癌。THBS1作為一種多功能蛋白質，有可能對腫瘤進展產生復雜作用。研究[10-11]證明THBS1上調細胞表面的胞漿素纖溶酶原形成，介導腫瘤細胞的組織侵襲。另有報道[12-16]通過體內體外實驗表明THBS1在腫瘤中的表達水平和腫瘤生長及轉移可能有關。然而，不同的細胞類型研究結果不同。有研究表明THBS1在腫瘤細胞中的表達上調，但也有研究表明其在腫瘤細胞中表達下調[5，17]。

本研究將前期成功構建的pcDNA3.1-THBS1真核表達載體以脂質體轉染至THBS1 mRNA表達水平最低的肺腺癌H1975細胞，采用細胞劃痕實驗檢測轉染前后H1975細胞遷移能力的變化，結果發現上調THBS1的表達可促進細胞遷移，與相關報道[3,18]一致。這一結果提示THBS1與肺腺癌細胞的遷移能力密切相關。

MMP是一個大家族，幾乎能降解細胞外基質中的各種蛋白成分,破壞組織學屏障，在腫瘤細胞遷移及侵襲轉移過程中起關鍵作用[19]。本研究結果顯示上調H1975細胞中THBS1的表達后，MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白的表達亦增加，提示THBS1基因過表達可能通過上調MMP-2和MMP-9的表達促進肺腺癌細胞的遷移，這一結論與胃癌中的報道[20]一致，但確切的分子機制尚需要進一步探討。

綜上所述，上調THBS1能促進肺腺癌細胞的遷移，其機制可能與上調MMP-2和MMP-9的表達有關，THBS1有可能成為發生轉移的肺腺癌患者分子靶向治療的靶點。