紫草素對皮膚鱗狀細胞癌細胞生長及PI3K/AKT信號通路的影響

王 潔，何振興，趙菊花，李 達，李 燃，楊 羽

1)西南醫科大學附屬醫院皮膚科 四川瀘州 646000 2)南充市中心醫院皮膚科 四川南充 637000 3)南充市中心醫院肝膽外科 四川南充 637000

皮膚鱗狀細胞癌是一種常見的發生于皮膚表皮的惡性腫瘤，其發生率較高，占皮膚惡性腫瘤的第二位，且發病率正逐年上升，已成為世界性的影響公眾健康的問題[1]。目前治療皮膚鱗狀細胞癌的主要方式是以手術切除為主，輔助以放療和化療，但這些治療方式對皮膚損傷較大，且患者依從性和預后較差[2]，因此尋找高效、低毒副作用的藥物具有重要的臨床意義。紫草素是傳統中藥紫草的主要活性成分，具有廣泛的抗炎、解毒、清熱、增強機體免疫力等生物學功能[3-4]。近年來的研究[5-8]發現，紫草素具有抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡的作用，對結腸癌、胃癌、口腔鱗癌等多種癌細胞的生長具有一定抑制作用。但紫草素是否影響人皮膚鱗狀細胞癌細胞的生長鮮有報道。有研究[9-10]指出，紫草素能夠抑制皮膚成纖維細胞增殖，誘導細胞凋亡，在瘢痕修復過程中起重要作用；且有促進和治療皮膚傷口愈合的功效；提示紫草素可能在皮膚鱗狀細胞癌治療中也具有一定的作用。本實驗采用不同濃度的紫草素干預人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞，觀察其對A431細胞生長的影響，并對其可能的作用機制進行探討。

1 材料與方法

1.1材料A431細胞購自天津奧爾生物科技有限公司，紫草素購自中國藥品生物制品檢定所，DMEM培養基購自美國Gibco公司，胰蛋白酶、胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；SYBR premix Ex Taq試劑盒購自日本TaKaRa公司；所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成；BCA蛋白定量試劑盒購自上海炎熙生物科技有限公司；ECL檢測試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；絲蘇氨酸蛋白激酶(AKT)抗體、磷酸化AKT(p-AKT)抗體購自美國Santa Cruz公司；二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；Annexin V-FITC/PI檢測試劑盒購自日本TaKaRa公司。

1.2細胞培養將A431細胞接種在含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養基中，置37℃、體積分數為5%的CO2培養箱中培養。每1～2 d換液，待細胞生長融合約90%時，以2.5 g/L的胰蛋白酶消化后傳代，取處于對數生長期的細胞用于實驗。

1.3CCK-8法檢測細胞活力取生長狀態良好的A431細胞，以2×104個/mL的密度接種于96孔板中，置37 ℃培養箱中繼續培養24 h。吸去舊培養液，將細胞分為4組：對照組(添加不含紫草素的培養液)，紫草素低劑量組(添加含10 μmol/L紫草素的培養液)，紫草素中劑量組(添加含20 μmol/L紫草素的培養液)，紫草素高劑量組(添加含40 μmol/L紫草素的培養液)，分別置于37 ℃培養箱培養24、48、72 h，每組細胞每個時間點設置3個復孔。在各個時間點每孔細胞中添加10 μL CCK-8溶液，于37 ℃條件下繼續孵育2 h，在酶標儀上測定在450 nm處的光密度值。實驗重復3次。

1.4細胞周期的檢測取對數生長期的A431細胞接種于6孔板中，每組設置3個復孔，置37 ℃培養箱中培養，按照1.3方法將細胞分為4組，分別處理24 h后收集細胞，用預冷的PBS洗滌細胞3次，用預冷的體積分數70%乙醇固定細胞，置4 ℃條件下過夜。每孔添加100 mg/L的RNase 10 μL和50 mg/L的PI 300 μL，4 ℃下避光孵育30 min，上流式細胞儀檢測細胞周期。

1.5細胞凋亡的檢測細胞分組及培養同1.3，干預24 h后，用預冷的PBS洗滌細胞，離心收集，加入1×Binding buffer制成單細胞懸液，分別向細胞中添加Annexin Ⅴ-FITC和PI各5 μL，混勻后室溫下避光孵育15 min，立即上流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.6細胞中增殖細胞核抗原(PCNA)和Cyclin B1mRNA的qRT-PCR法檢測細胞分組及培養同1.3。干預24 h后，收集細胞，Trizol法提取總RNA，采用反轉錄試劑盒合成cDNA，以SYBR premix Ex Taq試劑盒進行熒光定量PCR。以GAPDH為內參。反應條件為：95 ℃ 預變性3 min，95 ℃變性20 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，共40個循環。以2-ΔΔCt法計算目的mRNA相對表達水平。PCNA上游引物：5’-TTTGAGGCACGCCTGATC-3’，下游引物：5’-GATCAGGCGTGCCTCAAA-3’；Cyclin B1上游引物：5’-CATTATTGATCGGTTCATGC-3’，下游引物：5’-CTAGTGCAGAATTCAGCTGTGGTA-3’； GAPDH上游引物：5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游引物：5’-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3’。

1.7細胞中AKT及p-AKT的Western blot檢測細胞分組及培養同1.3。干預24 h后收集細胞，加入細胞裂解液，提取細胞總蛋白，以BCA定量。取30 μg蛋白樣品行SDS-PAGE電泳，轉膜，用含體積分數10%胎牛血清的封閉液封閉2 h，分別加入AKT、p-AKT一抗4 ℃過夜孵育。洗膜后加入二抗室溫孵育1 h，洗膜后以ECL化學發光，曝光、顯影、定影。以Image J軟件對圖像進行灰度分析，以GAPDH為參照。以目的條帶與GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白表達水平。

1.8統計學處理采用SPSS 21.0進行分析，應用析因設計的方差分析比較不同濃度紫草素作用不同時間對A431細胞活力的影響，應用單因素方差分析和SNK-q檢驗比較4組細胞周期、凋亡率、細胞中PCNA和Cyclin B1 mRNA及AKT和p-AKT蛋白表達水平，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.14組A431細胞活力的比較結果見表1。由表1可知，隨著作用劑量的增加以及作用時間的延長，紫草素對細胞活力的抑制作用值強。

表1 4組A431細胞活力的比較

F劑量=71.061,P<0.001；F時間=126.375,P<0.001；F交互=63.527,P<0.001

2.24組A431細胞周期的比較結果見表2。由表2可知，與對照組比，紫草素低、中、高劑量組S期和G2/M期細胞百分比均升高，G0/G1期細胞百分比降低(P<0.001)。

表2 4組A431細胞周期的比較 %

*：與對照組比，P<0.05；△：與紫草素低劑量組比，P<0.05；#：與紫草素中劑量組比，P<0.05

2.34組A431細胞凋亡的比較結果圖1。由圖1可知，與對照組[(5.62±1.03)%]相比，紫草素低劑量組[(16.24±2.24)%]、中劑量組[(28.38±3.17)%]和高劑量組[(36.49±4.62)%]細胞凋亡率均升高(F=58.897，P<0.001)。

圖1 細胞凋亡情況

2.44組A431細胞中PCNA和Cyclin B1mRNA表達的比較結果見表3。由表3可知，與對照組比，紫草素低劑量組、紫草素中劑量組和紫草素高劑量組細胞中PCNA和Cyclin B1 mRNA表達水平降低(P<0.001)。

表3 4組A431細胞中PCNA和Cyclin B1 mRNA表達水平的比較

*：與對照組比，P<0.05；△：與紫草素低劑量組比，P<0.05；#：與紫草素中劑量組比，P<0.05

2.54組A431細胞中AKT和p-AKT蛋白表達水平的比較結果見圖2和表4。由表4可知，與對照組比較，紫草素低、中、高劑量組細胞中p-AKT蛋白表達水平明顯降低；4組細胞中AKT蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)

1:對照組；2：紫草素低劑量組；3：紫草素中低劑量組；4：紫草素高劑量組

圖2 4組A431細胞中AKT和p-AKT蛋白的表達

*：與對照組比，P<0.05；△：與紫草素低劑量組比，P<0.05；#：與紫草素中劑量組比，P<0.05

3 討論

皮膚鱗狀細胞癌是多種因素(包括遺傳、紫外線照射、皮膚長期感染、電離輻射等)共同作用產生的一種惡性程度較高的腫瘤[11]。關于皮膚鱗狀細胞癌的發病機制目前尚不十分明確，在臨床上也無特效治療措施，因此探索皮膚鱗狀細胞癌的發生機制以及尋找有效治療藥物是目前亟待解決的問題。紫草素是從中藥紫草中提取的一類萘醌類化合物，常用于治療皮膚創傷、燒傷、潰瘍等癥狀[12]。目前研究顯示，紫草素具有廣泛抗癌作用。王汝興等[13]的研究顯示紫草素能夠在體外抑制乳腺癌細胞增殖，并通過促進Bax的表達、抑制Bcl-2的表達誘導細胞凋亡；在三陰性乳腺癌細胞系MDA-MB-468中，紫草素驅使RIP1K和RIP3K誘導細胞周期停滯，從而抑制細胞增殖[14]；紫草素通過調節人胃癌細胞AGS中p53和Nrf2的表達誘導細胞凋亡，抑制細胞生長[15]。本實驗通過CCK-8法檢測不同濃度的紫草素對人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞增殖的影響，發現紫草素干預24、48、72 h均能明顯抑制細胞活力，且隨著紫草素作用劑量的升高，抑制作用越強，呈劑量依賴性；紫草素能夠劑量依賴性地將A431細胞阻滯于S期和G2/M期，誘導細胞凋亡。

多項研究[16-17]指出，PI3K/AKT信號通路的激活能夠促進腫瘤細胞增殖、存活，阻礙細胞凋亡，促進腫瘤浸潤和轉移，促進腫瘤的發生和進展。PI3K活化后能夠激活AKT，催化AKT磷酸化。研究[18]已證實，在皮膚鱗狀細胞癌中PI3K/AKT信號通路被異常激活，p-AKT蛋白表達顯著升高。本實驗結果顯示，紫草素能夠抑制A431細胞中p-AKT蛋白表達，提示紫草素能夠抑制PI3K/AKT信號通路的激活。PCNA在細胞增殖啟動中具有重要意義，目前已將其作為反映腫瘤細胞增殖狀態的指標[19]。Cyclin B1是細胞周期進入M期所必需的蛋白之一，其含量的高低在一定程度上反映細胞周期進程[20]。本實驗結果顯示紫草素干預的A431細胞中PCNA和Cyclin B1 mRNA的表達下降。以上實驗結果提示，紫草素能夠通過抑制PI3K/Akt信號通路的激活，下調PCNA和Cyclin B1的表達，抑制A431細胞的生長。這與Yang等[21]的研究結果類似，紫草素衍生物可抑制Akt信號的激活，阻滯細胞周期于G1期，誘導黑色素瘤細胞凋亡，抑制細胞生長。Wang等[22]研究指出，紫草素通過調節PI3K/Akt信號通路保護軟骨細胞免受IL-1β誘導的細胞凋亡。

綜上，紫草素可能通過抑制PI3K/Akt信號通路，抑制皮膚鱗狀細胞癌細胞的生長，從而發揮抗腫瘤活性。但紫草素除抑制PI3K/Akt信號通路外是否還作用于其他信號通路發揮抗皮膚鱗狀細胞癌作用尚需進一步研究。