HPV感染患者陰道灌洗液人防御素5、人防御素2濃度測定

陳 飛，任琛琛，楊 立，張小安，劉 靈，賀 雯，王朝昕，魏心怡，潘雪景

鄭州大學第三附屬醫院婦產科 鄭州 450052

宮頸癌(cervical cancer, CC)居女性常見惡性腫瘤的第2位，高危型人乳頭瘤病毒(high risk human papillomavirus,HR-HPV)持續感染是宮頸癌及癌前病變的主要病因[1]。在HPV感染初期，HPV DNA以游離形式存在，不導致細胞高級別病變；在HPV持續感染中，HPV DNA與宿主DNA發生整合并轉錄產生E6/E7 mRNA[2]，因此E6/E7 mRNA不僅僅代表HPV持續感染，還可在一定程度上反映病變活躍程度[3]。

防御素是天然免疫系統的有效成分。人類表達α-防御素和β-防御素兩種防御素，已證實它們對包膜病毒和非包膜病毒都有抗病毒活性[4]。人類表達6種α防御素，多達31種β防御素[5]。HD-5是α-防御素的一種，在小腸的特殊上皮Paneth細胞及女性生殖系統的上皮細胞中均有表達[6]。HBD-2是β防御素的一種，已知在泌尿生殖系統上皮細胞中表達[7]。本研究旨在探討兩種防御素與HPV感染的關系，希望能為宮頸癌的治療提供參考。

1 對象與方法

1.1研究對象收集2017年10月至2018年3月在河南省內各區精準扶貧項目期間發現的HPV感染患者60例，同時納入同期篩查HPV陰性的婦女11例，均自愿接受宮頸脫落細胞HPV E6/E7 mRNA檢查，并收集陰道灌洗液。患者入選標準：既往接受HPV檢查，年齡20～75 歲，目前無妊娠，無生殖系統炎癥，無激素藥物使用史，無宮頸手術史，無全子宮切除手術史，未接受過盆腔放射治療或其他相關治療。

1.2流行病學問卷調查所有研究對象均需簽署知情同意書以及接受流行病學問卷調查，調查問卷自行設計，調查內容包括患者的一般情況如年齡、初次性生活年齡、孕次及年次等。

1.3HPV E6/E7mRNA檢測所有研究對象均在非月經期采樣，采樣前3 d停止使用陰道栓劑，前1 d禁止性生活。以窺陰器暴露宮頸，擦凈宮頸口分泌物，用宮頸刷細心收集宮頸管和宮頸口的脫落上皮細胞，并將標本置入盛有保存液的小瓶內。4 ℃保存，2周內檢測。將薄層液基細胞學標本作為HPV E6/E7 mRNA檢測標本來源，由技術員使用豪洛捷醫療科技有限公司生產的Aptima HPV HR試劑盒及Aptima HPV 16、18/45分型檢測試劑盒，采用轉錄介導的等溫擴增技術定性檢測14種高危型HPV E6/E7 mRNA，包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68型，本研究定性檢測高危型HPV 16、18/45型，分析物信號與閾值之比≥0.50為陽性。本研究將HPV E6/E7 mRNA作為HPV持續感染的分組依據。研究對象依據HPV E6/E7 mRNA檢測結果分為3組，HPV持續感染組(n=30)、HPV一過性感染組(n=30)、陰性對照組(n=11)。

1.4HD-5、HBD-2檢測取陰道灌洗液標本，用HD-5 ELISA 檢測試劑盒及HBD-2 ELISA 檢測試劑盒(武漢優爾生商貿有限公司)，按試劑盒要求進行檢測，每份標本均測3 孔，每次測定均設陽性和陰性對照，以陰性對照孔調零，測量450 nm波長下各孔的吸光度。繪制標準品標準曲線，計算HBD-2和HD-5濃度。

1.5統計學處理應用SPSS 21.0處理數據。采用單因素方差分析比較3組間一般情況及陰道灌洗液中HD-5、HBD-2水平的差異，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，采用χ2檢驗比較2 HPV感染組患者HPV感染情況的差異，Cut-off 值采用ROC曲線確定，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.13組一般情況比較結果見表1。

表1 3組一般情況比較

2.2HPV持續感染組和HPV一過性感染組HPV感染情況見表2。

表2 HPV持續感染組和HPV一過性感染組HPV感染情況 例(%)

2.33組陰道灌洗液中HD-5和HBD-2水平比較與陰性對照組相比，HPV持續感染組與HPV一過性感染組陰道灌洗液中HD-5、HBD-2水平均升高，但2 HPV感染組間差異無統計學意義，見表3。

表3 3組陰道灌洗液中HD-5和HBD-2水平比較 ng/L

*:與陰性對照組相比，P<0.05

2.4HD-5及HBD-2診斷HPV感染的效能HD-5曲線下面積為0.762，HD-5濃度最佳臨界值為37.54 ng/L，其在ROC曲線中對應的敏感度為58.3%，特異度為100%。HBD-2曲線下面積為0.775，HBD-2濃度最佳臨界值為458.5 ng/L，其在ROC曲線中對應的敏感度為53.3%，特異度為82.0%。

3 討論

3.1HPV E6/E7mRNA檢測在HPV篩查中的意義已有研究[8-9]表明高危型HPV持續感染是癌前病變及宮頸癌的主要病因。HPV感染致癌需經歷HPV DNA整合至宿主細胞DNA,轉錄為HPV E6/E7 mRNA，翻譯為HPV E6/E7蛋白最終致癌的過程。在高危型HPV感染中，有90%的感染在2 a內清除，只有10%的感染持續超過3 a，僅5%的高危型HPV感染在3 a內發展為宮頸高級別上皮內瘤變[10]。目前在 HPV 篩查方法中，HPV DNA檢測敏感性高但特異性較低， 薄層液基細胞檢測特異性較高但敏感性低。HPV DNA陽性只說明HPV“感染”，易造成患者心理壓力，并產生過度治療。與HPV DNA比較，HPV E6/E7 mRNA檢測敏感性相同，特異性顯著提高(20%～40%)，減少一過性HPV感染的檢出，減少不必要的陰道鏡轉診，減輕了患者不必要的心理壓力。因此本研究采用HPV E6/E7 mRNA作為篩查方法對HPV感染患者進行分組。

3.2HD-5在HPV感染中的意義HD-5是一種富含半胱氨酸的小肽， 在女性生殖道的多個上皮細胞內表達并分泌，在宮頸陰道灌洗液中也檢測到HD-5的存在[6]。在對HPV假病毒的研究中發現人HD-5能阻斷人皮膚和黏膜HPV的感染[11]，對宮頸癌的主要病因HPV感染有抑制作用，但其具體機制尚不明確。Wiens等[12]研究發現HD-5抑制HPV 16感染的可能機制是防御素與病毒衣殼直接結合所致，同時證實了HD-5在細胞表面與HPV 16共存時效果最好。本研究結果顯示，與陰性對照組相比，HPV持續感染組與HPV一過性感染組陰道灌洗液HD-5水平升高，但兩HPV感染組間差異無統計學意義，證實了防御素可能在HPV感染早期發揮作用，與Buck等[13]的研究HD-5在HPV感染早期及轉錄前發揮作用的結論一致。同時，進一步作ROC曲線，明確HD-5診斷HPV感染的效能，結果顯示HD-5濃度取37.54 μg/L時其診斷準確性最高，敏感度為58.3%，特異度為100%。

3.3HBD-2在HPV感染中意義HBD-2最初于1997從銀屑病皮損中分離出來，對革蘭陰性菌的殺滅效果最好。近年來有關HBD-2在HPV感染中的作用正逐步受到關注。宮頸癌相關研究[14]提示HBD-2在宮頸癌早期表達增加，同時提出HBD-2的表達可以作為宮頸腫瘤的輔助診斷標準，但具體在宮頸癌發展的哪個節點起作用并不明確。另外，在皮膚HPV感染如尖銳濕疣及外陰疣中HBD-2的表達也增加[15]。本研究結果顯示，HPV感染患者陰道灌洗液HBD-2的水平升高，但在HPV一過性和持續性感染患者中差異無統計學意義，提示HBD-2可能在HPV感染早期發揮作用，但對其機制仍需進一步探究。此外，研究還發現HBD-2 mRNA在HPV感染的其他病種如復發性呼吸性乳頭狀瘤病患者的乳頭狀瘤組織中的表達升高[7]。以上均表明，HBD-2可能具有抗HPV感染的作用。進一步作ROC曲線，明確HBD-2診斷HPV感染的效能，結果顯示HBD-2濃度取458.5 ng/L時其準確性最高，敏感度為58.3%，特異度為100%。

綜上所述，HD-5及HBD-2在HPV感染早期起關鍵作用，可作為宮頸腫瘤的輔助診斷標準。