洛索洛芬鈉對急性痛風性關節炎大鼠血清IL-1β和滑膜組織中NF-κB蛋白表達的影響

江 丹，熊金河，尚 華

遂寧市中心醫院風濕免疫科 四川遂寧 629000

急性痛風性關節炎(acute gouty arthritis，AGA)是因嘌呤代謝紊亂與尿酸代謝異常引起的一種疾病[1]，發病率逐年攀升[2]。AGA是一種臨床較為常見的軟組織損傷慢性炎癥性疾病，具有遷延不愈、反復發作的特點，若不及時治療會引起臟器功能障礙而嚴重降低生活質量[2-3]。洛索洛芬鈉屬于臨床常用的非甾體類抗炎藥，在減輕AGA引發的疼痛和炎癥時效果明顯[4]。通過前期研究[5]，本課題組發現洛索洛芬鈉治療AGA有顯著的效果。核轉錄因子-κB(Nuclear factor-kappa B，NF-κB)在調控宿主的炎癥中發揮重要的作用[6-9]。本實通過采用向膝關節注射尿酸鈉的方法來建立AGA大鼠模型，觀察洛索洛芬鈉對AGA大鼠IL-1β和NF-κB表達的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器洛索洛芬鈉片(迪沙藥業集團有限公司，國藥準字：H20050437)；秋水仙堿片(云南植物藥業有限公司，國藥準字：H53020166)；尿酸購自美國Sigma公司；IL-1β ELISA檢測試劑盒購自美國Abcam公司。凝膠成像系統由美國GE公司提供；ELx800酶標儀(美國BioTek公司產品)；伯樂小型垂直電泳儀及電泳槽、伯樂全能型蛋白快速轉膜儀(美國Bio-Rad公司產品)。

1.2尿酸鈉溶液的制備尿酸2 g加入400 mL水(100 ℃) 中，再用氫氧化鈉溶液調pH至7.4。自然冷卻至25 ℃。攪拌后4 ℃冷藏過夜。過濾析出的絮狀沉淀，得到微晶型尿酸鈉，80 ℃干燥。稱量1 g尿酸鈉，研磨后加入20 mL無菌生理鹽水，獲得50 g/L尿酸鈉混懸液。

1.3實驗分組與模型建立雄性清潔級6～8周齡SD大鼠50只，體重210～250 g，購自四川大學的實驗動物中心。大鼠在無菌消毒、室溫25～27 ℃、濕度45%的安靜空間中飼養，飲用消毒過的水，保證大鼠身體健康無營養不良及其他疾病。將50只大鼠分為：正常組(n=12)、模型組(n=12)、治療組(n=13)，陽性對照組(n=13)。除正常組外均建立AGA模型：大鼠仰臥，清潔膝關節的皮毛。膝關節內注入尿酸鈉，誘導急性關節炎。模型組、治療組、陽性對照組大鼠每個關節注射0.2 mL尿酸鈉懸液，正常組注射等量生理鹽水。隨后治療組大鼠給予0.3 mg/kg洛索洛芬鈉，陽性對照組給予0.3 mg/kg秋水仙堿，均混合10 mL溫開水灌胃，其余兩組給予生理鹽水。灌胃時間為每天8：00，1次/d，連續7 d。

1.4關節腫脹度測定測量實驗動物關節直徑并記錄，由專人完成，時間點分別為造模前、造模完成后的1、2、4、6、8、24 h。每次測量3次，獲取3個數值，取其平均值記錄。建模后取不同時間點測量數值，將其與建模前的數值相減，所獲取數值為關節腫脹度。

1.5步態分級與評分建立實驗動物模型24 h后對其行走步態進行觀察，并對其進行分級。其中0級為正常狀態，評為0分；1級可見下肢彎曲，程度不重，評為1分；2級較前者為重，行走時可接觸地面，但已見下肢明顯異常，評為2分；3級跛行十分明顯，行走時下肢已不接觸地面，評為3分。

1.6IL-1β的水平檢測于建模24 h后進行。水合氯醛麻醉實驗動物。大鼠仰臥，固定四肢，充分暴露腹部。將腹部剪開，尋找到腹主動脈，進行穿刺，獲取血液標本，室溫下靜置1 h。3 000 r/min離心15 min，吸取上清，應用ELISA試劑盒進行檢測。

1.7Western blot法檢測滑膜組織中NF-κB的蛋白表達處死實驗動物，分離出膝關節滑膜組織，放入干凈研磨器于冰上操作。加入RIPA裂解液研磨后獲取勻漿，提取總蛋白。每孔上樣50 μg蛋白，上樣前加入等體積2×Loading buffer煮沸5 min，設置積層膠中90 V電壓電泳，分離膠中120 V電壓電泳，電泳2.5 h。將蛋白在200 mA恒流條件下轉移到PVDF膜上，經體積分數5%牛血清白蛋白室溫封閉120 min后，加1∶600稀釋后的一抗于4 ℃條件下孵育10 h，加1∶2 000稀釋后的二抗在室溫中孵育約2 h。用ECL發光試劑盒發光后顯影。以Quantity One軟件分析NF-κB、β-actin條帶的灰度值，NF-κB蛋白表達水平=NF-κB條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.8HE染色取大鼠膝關節滑膜組織石蠟包埋，4 μm厚切片，放置在經過防脫片處理的干凈載玻片上，置恒溫箱中50 min，二甲苯脫蠟。乙醇水洗后蘇木精處理5 min；蒸餾水沖洗切片10 min。應用體積分數0.5%～1.0%鹽酸乙醇分化， 3～5 s(藍色至紅色)，沖洗10 min。伊紅染色20 s，蒸餾水沖洗10 min。使用梯度乙醇脫水，二甲苯至透明，中性樹膠封片，高倍顯微鏡下觀察。

1.9統計學處理應用SPSS 22.0分析。各組各時間點AGA大鼠膝關節腫脹程度比較行重復測量數據的方差分析，各組大鼠血清IL-1β水平和滑膜組織中NF-κB蛋白表達的比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1各組大鼠不同時間點膝關節腫脹程度比較結果見表1。

表1 各組大鼠不同時間點膝關節腫脹程度比較

F組間=138.895，F時間=497.746，F交互=15.612，P均<0.001

2.2各組大鼠步態變化除正常組外，其他各組大鼠活動受到影響，肢體發生變形，關節腫脹顯著，行走時明顯異常，甚至離開地面，其中模型組最為明顯。模型組、治療組、陽性對照組大鼠步態評分分別為(2.96±0.33)、(1.38±0.24)、(1.25±0.32)分，3組比較差異有統計學意義(F=260.740，P<0.001)，其他兩組評分較模型組降低 (P<0.05)。

2.3各組大鼠血清中IL-1β水平和各組大鼠滑膜組織中NF-κB蛋白的表達的比較結果見圖1和表2。

1～4：分別為正常組、模型組、治療組和陽性對照組

組別IL-1βNF-κB正常組17.82±4.110.23±0.07模型組45.21±7.65?0.91±0.30?治療組21.11±3.56?#0.60±0.20?#陽性對照組20.13±4.78?#0.54±0.18?#F72.12322.241P<0.001<0.001

*：與正常組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05

2.4各組AGA大鼠的病理變化見圖2。正常組關節滑膜組織周圍軟組織、關節、滑膜和軟骨細胞正常，無炎性細胞，無增生。模型組尿酸鹽結晶沉積、炎性細胞浸潤，排列不規則，成纖維細胞及滑膜出現增生，組織出現壞死且有炎性滲出。治療組和陽性對照組上述改變較模型組明顯減輕。

A:正常組；B:模型組；C:治療組；D:陽性對照組

3 討論

AGA的發病主要是由于尿酸鈉結晶在關節及其周圍淤積所致，從而引起炎癥級聯反應，導致一些促炎細胞因子和中性粒細胞聚集[10-11]。NF-κB信號通路是一種普遍存在于所有細胞中的重要核轉錄因子之一，在細胞黏附、免疫和炎癥反應中起著中心介質的作用[12]。在AGA發病過程中，激活NF-κB信號通路導致體內的炎性細胞因子在細胞核內不斷地產生和釋放，炎癥反應不斷加重[13]。

洛索洛芬鈉是臨床常用的非甾體類抗炎藥。本文研究結果提示洛索洛芬鈉能夠緩解AGA所導致的大鼠膝關節腫脹、改善模型大鼠的步態變化。本研究結果顯示，AGA模型組血清中IL-1β含量升高，治療組與陽性對照組血清中IL-1β含量均降低；模型組滑膜組織中NF-κB蛋白表達增高，治療組與陽性對照組降低。以上結果提示洛索洛芬鈉可能抑制了嚴重骨破壞的進展。

綜上所述，洛索洛芬鈉對大鼠急性痛風性關節炎具有一定的改善作用，其機制與抑制NF-κB信號通路有關。