河南地區(qū)248例兒童急性淋巴細胞白血病融合基因類型分析

徐一卓，王西閣，陳力溶

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院血液科 鄭州 450052

急性白血病約占所有兒童惡性腫瘤的30%，其中急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)約占兒童白血病的75%～80%;目前ALL患兒的總體長期無事件生存率已達80%～90%，但因白血病細胞系列歸屬及分化階段的不同，仍有小部分患兒療效欠佳[1-2]。于疾病早期進行MICM分型(即細胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)分型)對白血病的類型分析、治療方案的選擇和療效判定有重要作用。根據(jù)融合基因的不同特性調(diào)整治療方案，可以提高兒童ALL的生存率[3]。本研究對248例河南地區(qū)ALL患兒(骨髓標本來自于鄭州大學(xué)第三、第一附屬醫(yī)院)進行融合基因檢測、染色體核型分析、免疫分型，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 對象與方法

1.1研究對象收集2015年12月至2018年11月河南地區(qū)骨髓標本送檢康圣環(huán)球公司的ALL患兒的資料。ALL診斷標準參照2014年制定的兒童急性淋巴細胞白血病診療建議(第四次修訂草案)[4]。全部患兒均進行白血病MICM分型。248例患兒均為河南戶籍，且檢查前未接受過任何抗白血病治療，均為非繼發(fā)性ALL，未合并其他腫瘤及遺傳代謝病。248例中，男144例，女104例，男女比例為1.38∶1；初診年齡23 d～18歲,<1歲15例，1～10歲168例，>10歲65例。

1.2免疫分型使用流式細胞儀，于CD45/SSC設(shè)門分析骨髓標本，應(yīng)用單克隆抗體對白血病細胞表面抗原進行標記。分型標準按照2014年制定的兒童急性淋巴細胞白血病診療建議(第四次修訂草案)[4]，可分型為T-ALL和B-ALL，B-ALL包括pro-B-ALL、per-B-ALL、common B-ALL及mature B-ALL亞型。

1.3融合基因檢測取初診時的EDTA-K2抗凝骨髓標本，Trizol法提取有核細胞RNA，采用多重巢式RT-PCR技術(shù)，定性檢測15種常見白血病融合基因。采用杭州博日Life Pro擴增儀，試劑盒為科研用ALL融合基因檢測試劑盒(美國OMEGA公司)。檢測的基因包括MLL/AF4、SIL/TAL1、ETV6/RUNX1、dupMLL、MLL/ENL、E2A/PBX1、SET/CAN、BCR/ABL、TLS/ERG、E2A/HLF、CALM/AF10、HOX11L2、HOX11、MLL/AF10、NPM/ALK等。

1.4染色體核型分析肝素抗凝骨髓標本應(yīng)用植物血凝素進行短期培養(yǎng)后立即制片，收集有絲分裂的骨髓中期細胞行吉姆薩染色，經(jīng)顯帶，于染色體分析儀上進行染色體核型分析。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 21.0進行統(tǒng)計分析。采用χ2檢驗或精確概率法比較不同年齡組患兒性別構(gòu)成、免疫分型分布及融合基因陽性率，以及不同融合基因類型患兒性別構(gòu)成、免疫分型分布，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1免疫分型248例中，28(11.3%)例為T-ALL，18(7.3%)例為pro-B-ALL，37(14.9%)例為pre-B-ALL，163(163.7%)例為common B-ALL，2(0.8%)例為mature B-ALL。各年齡組患兒性別分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義，免疫分型分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

表1 河南地區(qū)各年齡組ALL患兒性別及免疫分型構(gòu)成的比較

*:χ2=1.130，P=0.568;#:P<0.001

2.2融合基因248例患兒中,98(39.5%)例檢出白血病基因。ETV6/RUNX1陽性26(10.5%)例；BCR/ABL陽性22(8.9%)例，其中 P190亞型16例，P210亞型5例，P230亞型1例；E2A/PBX1陽性19(7.7%)例；MLL陽性18(7.3%)例，其中AF4陽性14例，ENL陽性4例；SIL/TAL1陽性8(3.2%)例；HOX11陽性3例；E2A/HLF陽性2例。未檢出dupMLL、MLL/ENL、SET/CAN、TLS/ERG、CALM/AF10、HOX11L2、MLL/AF10、NPM/ALK。各類融合基因患兒的免疫分型分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表2)。不同年齡組各融合基因分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表3)，<1歲組均為MLL陽性，1～10歲組ETV6/RUNX1陽性率最高，>10歲組BCR/ABL陽性率最高。

表2 河南地區(qū)不同常見融合基因類型ALL患兒免疫分型構(gòu)成的比較

*:χ2=2.072，P=0.863;#:P<0.001

表3 河南地區(qū)不同年齡組ALL患兒融合基因構(gòu)成的比較

2.3染色體核型分析248例患兒中，27例未進行染色體核型分析，51例分裂象過少無法統(tǒng)計分析。可供分析的170例患兒中，93例核型正常；77例呈現(xiàn)異常核型，其中41例表現(xiàn)為染色體數(shù)量異常(包括亞二倍體11例、超二倍體30例)， 36例染色體結(jié)構(gòu)異常。檢測出與BCR/ABL融合基因相關(guān)的t(9；22)(q34；q11)12例，與E2A/PBX1融合基因相關(guān)的t(1；19)(q21；q13)13例，與MLL基因相關(guān)的11q23易位11例，未檢出與ETV6/RUNX1融合基因相關(guān)的t(12；21)(p13；q22)。

3 討論

融合基因與ALL患兒預(yù)后關(guān)系密切，是影響療效的重要指標之一[5]。本組ALL患兒采用多重巢式RT-PCR方法檢測15種白血病基因，陽性率達到39.5%，共檢出8種白血病融合基因，包括ETV6/RUNX1、MLL/AF4、MLL/ENL、E2A/PBX1、BCR/ABL、SIL/TAL1、HOX11和E2A/HLF，均是最為常見的白血病融合基因。

Hong等[6]的研究結(jié)果顯示，ETV6/RUNX1是兒童ALL中最常見的異常融合基因，在兒童B-ALL中占20%～`25%。ETV6/RUNX1早在胎兒造血期就已形成，其剩余拷貝的缺失可造成前白血病干細胞轉(zhuǎn)化為白血病干細胞[7]。ETV6/RUNX1干擾了其野生型等位基因的正常功能，容易引發(fā)ALL；該融合基因具有較好的穩(wěn)定性，可以降低天冬酰胺酸合成酶活性，所以患兒多對左旋門冬酰胺酶敏感。此類患兒具有初期白細胞計數(shù)通常不高，化療效果佳，完全緩解期長，早期不易復(fù)發(fā)，遠期可能有少部分患兒復(fù)發(fā)等臨床特點，因此目前通常認為ETV6/RUNX1陽性是兒童ALL預(yù)后好的標志；這類患兒可以應(yīng)用較弱的化療方案，以減輕化療的副作用但不降低無病生存率[8]。本研究資料顯示，本組ALL患兒ETV6/RUNX1陽性率為10.5%，且患兒均為B-ALL。本組陽性率結(jié)果低于文獻[9]報道，可能與地域和種族分布有關(guān)。Zuna等[7]報道該基因與染色體t(12；21)易位相關(guān)，但本組ETV6/RUNX1陽性患兒未檢出t(12；21)(p13;q22)相關(guān)改變，說明該融合基因檢測時結(jié)合染色體核型分析更有意義。

E2A/PBX1在兒童ALL中占3%～5%，5%的成年ALL中也可出現(xiàn)，多為B-ALL，少見于T-ALL。E2A/PBX1參與免疫球蛋白基因的重排，可調(diào)節(jié)成熟B細胞并且影響胸腺細胞的增殖分化，在淋巴細胞的成熟分化方面發(fā)揮重要作用[10]。此類患兒具有發(fā)病年齡偏大、初診時白細胞計數(shù)高等特點，多提示患兒預(yù)后不良；但行高強度化療后E2A/PBX1轉(zhuǎn)陰的患兒仍有較高的無病生存率；如治療后該基因仍表達陽性，則患兒后期可能有較高的復(fù)發(fā)率[11]。本組ALL患兒E2A/PBX1陽性率為7.7%，且均發(fā)生于B-ALL，較多見于pre-B-ALL，此結(jié)果略高于文獻報道，不排除與本組病例總數(shù)較少有關(guān)，但有資料[12]顯示，該基因陽性率與地區(qū)及人種有關(guān)。

MLL基因重排在兒童ALL中占2%～6%，大部分發(fā)生于白血病嬰兒，其他年齡段少見[13]。重排相關(guān)基因位于染色體11q23，可發(fā)生易位、重復(fù)串聯(lián)和擴增等改變，最終引起造血干細胞惡性增殖[14]。MLL重排多見于B-ALL，通常為pro-B-ALL，T-ALL少見。本組ALL患兒的MLL重排陽性率為7.3%，略高于文獻報道[15]。MLL相關(guān)的伙伴基因很多，常見的有AF4、AF9、ENL、AF6和AF10。這類患兒具有特殊的臨床和生物學(xué)特性：初診時白細胞計數(shù)高，常規(guī)化療效果欠佳，且對大劑量糖皮質(zhì)激素耐藥，完全緩解率低，生存期短，特別是<1歲的患兒預(yù)后更差；短時間內(nèi)行高強度化療可提高生存率，但總體預(yù)后相對較差；造血干細胞移植的預(yù)后是否優(yōu)于單純化療仍存爭議[16]。已有實驗[17]表明，通過RNA干擾技術(shù)抑制組蛋白H3賴氨酸79(H3K79)甲基轉(zhuǎn)移酶(DOT1L)表達可以消除MLL-AF10和MLL-AF4的轉(zhuǎn)化能力，以DOT1L抑制劑為代表的靶向治療是今后發(fā)展的方向。

BCR/ABL融合基因在兒童ALL中占3%～5%，而在成人B-ALL中可達20%～25%，其發(fā)生率與年齡顯著相關(guān)；BCR/ABL系t(9；22)易位所致，常見3種亞型，分別為P190、P210、P230[18]。本組ALL患兒BCR/ABL陽性率為8.9%，稍高于文獻報道，可能與>10歲患兒所占比例較高有關(guān)。此類患兒初診時白細胞計數(shù)較高，易發(fā)生中樞系統(tǒng)白血病，完全緩解率低且早期復(fù)發(fā)率高。酪氨酸激酶抑制劑(TKI)是特異性BCR/ABL蛋白激酶的靶向治療藥物，通過與BCR/ABL上的ATP結(jié)合域相結(jié)合來阻斷酪氨酸激酶的磷酸化，進而阻斷BCR/ABL蛋白激酶活性，抑制白血病細胞增殖。目前化療聯(lián)合TKI已經(jīng)成為BCR/ABL陽性ALL的常規(guī)治療方法，造血干細胞移植也不再作為第一次緩解預(yù)后的首選治療手段；早期加用伊馬替尼能夠使患兒盡早獲得完全緩解，長期生存率得到顯著提高[19-20]。

SIL/TAL1基因均出現(xiàn)于T-ALL患兒中，約25%的T-ALL患兒可檢測到該基因；SIL/TAL1與1q32的微缺失相關(guān)，通過直接影響TAL1基因的轉(zhuǎn)錄和表達，調(diào)控造血細胞的發(fā)育過程，導(dǎo)致T細胞發(fā)生惡性增殖[21]。有研究[22]顯示伴有SIL/TAL1基因重排的T-ALL患者雖然首次緩解率較高，但有較高的復(fù)發(fā)率、較短的無復(fù)發(fā)生存期，預(yù)后較差。本組28.6%的T-ALL患兒該基因陽性，總陽性率稍高于文獻報道[21-22]，可能與本組病例總數(shù)，尤其是T-ALL病例數(shù)較少有關(guān)。

本組資料顯示，河南地區(qū)不同年齡段ALL兒童的融合基因陽性率存在差異，可能與地域、種族及納入病例的臨床特點有關(guān)。通過對兒童ALL融合基因的分析，可以進行危險度分組并分層，為白血病患兒的治療及預(yù)后提供一定的參考。