成纖維細胞生長因子結合蛋白2過表達促進食管癌細胞的增殖

孫曉男，苑 青，楊荔艷，張 鈺，蔡 巖，徐 昕，王明榮，郝佳潔，*，賈雪梅*

(1．安徽醫科大學組織胚胎學教研室，安徽合肥 230032；2．國家癌癥中心/中國醫學科學院北京協和醫學院分子腫瘤學國家重點實驗室，北京 100021)

食管癌是人類消化道惡性腫瘤之一。食管癌的主要病理類型包括食管鱗癌和食管腺癌。中國人群最常見的病理類型為食管鱗癌[1-2](以下簡稱“食管癌”)。在中國，食管癌的發病率在惡性腫瘤中排名第5，死亡率排名第4[3]，某些地區仍是世界上食管癌發病率最高的地區之一[4]。食管癌是一種進展迅速、預后較差的惡性腫瘤。一旦被診斷為食管癌，超過50%的患者為晚期腫瘤或伴有影像學上可見的遠處轉移瘤[5]。雖然大部分食管癌患者可以通過手術治療，但仍有許多患者死于局部復發、病情進展及遠處轉移[6]。食管癌患者(包括食管腺癌患者)的總體5年生存率僅為15%~25%[7]。病理分期可以作為臨床預后判斷指標，但相同分期患者的預后可能存在很大差異，因此尋找與食管癌預后有關的分子標志物，對于食管癌患者臨床治療和提高生存率具有重要意義。

FGFBP2屬于纖維母細胞生長因子結合蛋白家族基因，編碼KSP37蛋白。據報道，KSP37蛋白是由細胞毒性淋巴細胞CTL和NK細胞選擇性分泌的。KSP37蛋白表達升高與輕度外源性哮喘密切相關[8-9]。研究表明，FGFBP在致癌物誘導的皮膚狀細胞癌和一些結腸腫瘤組織中高表達[10]。Yamanaka等[11]觀察到FGFBP2低表達與膠質瘤患者的不良預后密切相關。然而，FGFBP2與食管癌之間的關系及其作用仍不清楚。

本研究中，我們采用組織微陣列聯合RNA原位雜交技術檢測FGFBP2 mRNA在食管癌組織中的表達，分析了FGFBP2 mRNA表達與食管癌患者臨床病理參數和術后生存時間的相關性，探討FGFBP2 mRNA表達是否可以作為食管癌預后判斷的分子標志物。進一步通過功能研究，檢測敲降FGFBP2對食管癌細胞系惡性表型的作用。

1 材料與方法

1.1 臨床標本信息

190例食管癌組織和42例配對手術切緣形態學正常的組織(癌旁組織)，取自河南省林州市人民醫院病理科，上述標本來源于190例食管癌患者手術切除組織，其中71名患者具有完整的預后信息。本研究中使用的組織均為病理診斷后剩余的標本。所有患者術前均未接受任何治療，并簽署了知情同意書。本研究的設計和開展獲得了中國醫學科學院腫瘤醫院倫理委員會的批準(16-084/1163)。

1.2 組織芯片制備

組織標本先經過福爾馬林固定，石蠟包埋。然后切成厚度為4 μm的切片進行蘇木精和伊紅(HE)染色，顯微鏡下閱片，選取相應的組織蠟塊標記。每個病例選取3個腫瘤組織點和2個正常組織點。將標記好的供體蠟塊組織移入受體蠟塊，切成厚度為(5±1)μm的組織微陣列。

1.3 RNA原位雜交及評分標準

FGFBP2的RNAscope探針購自Advanced Cell Diagnostics公司(ACD，Newark，LA)。相關程序參照說明書進行。組織芯片經過二甲苯脫蠟和梯度乙醇洗滌兩次后，雙氧水處理10 min，靶標修復液修復15 min；進行RNAscope探針雜交及放大處理，DAB顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片后用NanoZoomer數字病理切片掃描儀(日本濱松)掃描。

評分采取雙盲原則。FGFBP2 mRNA表達水平根據染色強度和陽性細胞百分比確定。染色強度分為0(陰性)、1(弱陽性)、2(中度陽性)、3(強陽性)。陽性細胞比例分為 0(0)、1(1%~20%)、2(21%~50%)、3(51%~100%)。腫瘤細胞染色強度×陽性細胞百分比的平均得分代表標本的最終得分。≥3分被認為是陽性。

1.4 細胞培養

人體食管癌細胞系KYSE30、KYSE70、KYSE140、KYSE150、KYSE450和KYSE510由日本京都大學的Shimada Y教授惠贈。細胞培養條件參考本實驗室前期發表論文[13]。

1.5 小干擾RNA(siRNA)轉染

FGFBP2 siRNA由上海GenPharma公司合成，其序列為：敲降靶點1(5′-CCTGACAGACAACCATCTCTT-3′)、敲降靶點 2(5′-GAACATTGTTGGAAACCCTTC-3′)和陰性對照 siRNA(5′-TTCTCCGAACGUGUCACGT TT-3′)。 使 用 Lipofectamine 2000(Invitrogen)轉 染 48 h，采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)檢測轉染效率。

1.6 RNA提取、cDNA合成和實時定量PCR

使用RNApure組織和細胞總RNA提取試劑盒(康為世紀)提取細胞中總RNA。使用HiFi Script cDNA合成試劑盒(康為世紀)進行逆轉錄。qPCR操作步驟如文獻[13]所述。引物序列：FGFBP2，5′-AGAGATTCCT GCACTATGCGT-3′(正向)，5′-ACACCAGTAGGTCTG GTCTGT-3′(反向)；內參 GAPDH，5′-TAGGCGCTCA CTGTTCTCT-3′(正 向)，5′-GTTAAAAGCAGCCCTGG TGAC-3′(反向)。

1.7 細胞增殖檢測

在KYSE150和KYSE510中轉染FGFBP2 siRNA培養48 h后，收集細胞并進行計數，取1 000個細胞接種于含有100 μL RPMI-1640培養基的96孔板中，每組設置3個平行孔，于37℃、CO2體積分數為5%的培養箱中培養，每天取出一塊96孔板進行檢測。CCK-8(日本同仁化學)用RPMI-1640按1∶10比例稀釋，每孔加入100 μL的CCK-8稀釋液，于37℃培養箱中培養1 h。用酶標儀(BioTek)在450 nm處測量細胞的吸光度值，以不同處理組的吸光度值為縱坐標，培養時間為橫坐標，繪制細胞生長曲線。

1.8 Western blot

轉染48 h后收集細胞，用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液提取總蛋白。加入5×上樣緩沖液，100℃煮沸10 min。采用Pierce BCA蛋白檢測試劑盒(Thermo)測定蛋白濃度。20 μg蛋白質樣品經過SDS-PAGE凝膠電泳和PVDF轉膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗孵育過夜，二抗孵育1 h。采用超增強化學發光試劑(普利萊)檢測發光信號。

實驗過程中所用的AKT、p-AKT、ERK、p-ERK和E-cadherin一抗購自Cell Signaling Technology公司，均以1∶1 000比例稀釋。GAPDH(Cell Signaling Technology)以1∶5 000比例稀釋作為內參。

1.9 統計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。使用χ2檢驗分析FGFBP2 mRNA在食管癌組織和正常組織中的表達差異。采用Kruskal-Wallis或Mann-WhitneyU方法分析FGFBP2 mRNA表達與臨床病理指標之間的相關性。繪制Kaplan-Meier生存曲線，確定FGFBP2 mRNA表達與食管癌患者總生存時間的關系。單因素及多因素Cox回歸分析不同因素對患者生存的影響。生存分析針對的是總生存時間，指的是患者從手術之日起到因食管癌死亡的時間或最后一次隨訪確定患者己死亡的時間。如到隨訪截止終點患者仍存活，則此隨訪數據截止。采用t檢驗對細胞增殖、侵襲和遷移數據進行組間差異比較。以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 FGFBP2 mRNA在食管癌患者癌組織中的表達

我們對190例食管癌組織和42例癌旁組織進行mRNA原位雜交檢測，結果顯示食管癌組織中FGFBP2 mRNA的表達陽性率為25.8%(49/190)，而在癌旁組織中不表達(圖1)。FGFBP2 mRNA的表達水平在腫瘤組織和癌旁正常組織中的表達差異具有統計學意義(P<0.01)，見表1。

表1 食管癌組織和癌旁正常組織中FGFBP2 mRNA的表達情況

2.2 FGFBP2 mRNA表達情況與食管癌患者臨床病理指標的關系

我們分析了FGFBP2 mRNA的表達與食管癌患者臨床病理指標之間的關系(表2)。結果顯示，FGFBP2mRNA陽性表達與性別、年齡、T分期、淋巴結轉移、分化程度和病理分期等指標均無顯著相關關系(P>0.05)。

表2 FGFBP2 mRNA表達與食管癌患者臨床病理指標的關系

2.3 FGFBP2 mRNA表達與食管癌患者預后的關系

對具有隨訪資料的病例進行Kaplan-Meier分析，結果顯示FGFBP2 mRNA表達影響食管癌患者術后生存時間，且FGFBP2 mRNA表達陽性患者的總生存時間明顯短于mRNA表達陰性的患者(P=0.002，圖2)。

圖2 食管癌患者FGFBP2 mRNA表達的Kaplan-Meier生存分析圖

我們對食管癌患者臨床病理指標和FGFBP2 mRNA表達進行了Cox單因素回歸分析，進一步選取淋巴結轉移和FGFBP2 mRNA表達進行了多因素回歸分析，結果顯示FGFBP2 mRNA表達可作為食管癌患者的一個獨立預后影響因素，危險度為2.291，95%置信區間為1.271~4.129(P=0.006)，見表3。

表3 Cox回歸分析

2.4 敲降FGFBP2抑制食管癌細胞的增殖

利用qPCR技術檢測6株食管癌細胞系中FGFBP2的表達，結果顯示KYSE150和KYSE510中FGFBP2 mRNA水平高于其他細胞系(圖3A)，因此我們選取這兩種細胞系進行敲降實驗。與對照組相比，敲降FGFBP2基因可顯著抑制KYSE150和KYSE510細胞FGFBP2 mRNA的表達(圖3B，KYSE150細胞未給出)和增殖(圖3C和3D)。我們進一步檢測了與增殖相關分子的表達情況。Western blot結果顯示，在KYSE150和KYSE510中敲降FGFBP2后，AKT的磷酸化水平降低，而ERK的磷酸化水平未發生改變(圖4)。

3 討論

圖3 敲降FGFBP2抑制食管癌細胞的增殖

圖4 敲降FGFBP2后下游分子的變化

腫瘤預后分子標志物的研發可能為腫瘤患者的治療提供潛在的靶點、療效預測及評價指標。目前已有大量報道采用qPCR技術獲得食管癌潛在的預后判斷mRNA標志物，例如ANRIL[14]、GOLM1-NAA35[15]等，也有非常少量的研究采用常規RNA原位雜交技術發現食管癌患者預后相關mRNA分子，例如Stathmin[16]、HCCR-1[17]等。然而，由于mRNA容易降解，特別是經福爾馬林固定和石蠟包埋組織中的mRNA，導致qPCR和常規RNA原位雜交對于檢測固定和包埋組織中的mRNA均有明顯的局限性。因此，目前尚無任何一種mRNA標志物應用于食管癌臨床檢測。

RNAscope原位雜交是近年來發展的一種用于檢測細胞以及經固定和包埋組織中目標RNA分子的原位雜交新技術，其利用雙“Z”探針(靶RNA識別序列長約18～25個堿基)和信號放大系統，保證信號的特異性和強度，具有較高的靈敏度和較低的背景。特別是，該技術對于檢測石蠟組織中的RNA分子，可以獲得穩定可靠的結果。由于該技術通常針對目標RNA設計多對探針(可達20對)，利用多個短探針覆蓋目標RNA較長的片段，可以彌補固定和包埋樣品中部分RNA降解對信號強度造成的影響[18-20]。越來越多的研究利用RNAscope原位雜交技術發現了腫瘤患者預后相關mRNA分子[21-24]。因此，該技術有望成為腫瘤病理診斷、治療和預后判斷的手段之一。Du等[25]通過對食管癌冰凍組織進行Western blot分析，以及對石蠟組織進行RNAscope原位雜交分析，驗證了KRT17蛋白和mRNA在食管癌細胞中均存在高表達，而在正常上皮細胞中不表達，表明RNAscope檢測結果具有較高的穩定性。然而，到目前為止，在食管癌中使用該技術原位檢測RNA分子的研究很少，且尚無關于預后判斷RNA標志物的報道。在本研究中，我們對食管癌組織中FGFBP2 mRNA進行了RNAscope檢測分析，發現FGFBP2 mRNA在腫瘤組織中的表達水平顯著升高。我們的結果顯示，FGFBP2 mRNA僅在腫瘤細胞中高表達，而在正常組織、以及腫瘤中的間質細胞中均不表達，且原位雜交信號反差強；同時，其在預后較好和預后較差患者的腫瘤細胞中的信號反差也較明顯，表明該探針具有較高的特異性。我們發現FGFBP2 mRNA表達是食管癌患者的一個獨立預后影響因素，提示其有潛力作為食管癌患者預后判斷的分子標志物，以及為T分期、淋巴結轉移和分化程度等臨床病理指標提供有效補充。

目前尚無關于FGFBP2在腫瘤發生發展中相關機制的研究報道。本研究結果揭示了FGFBP2在食管癌細胞中的潛在作用和相關信號通路的變化，發現FGFBP2高表達通過激活AKT信號通路，進而促進食管癌細胞的增殖。癌細胞增殖是腫瘤發生發展的重要特征，其受到缺氧誘導因子1、磷酸肌醇3激酶(PI3K)/AKT絲氨酸/蘇氨酸激酶1(AKT)、胰島素樣生長因子受體1、細胞周期相關蛋白、以及雄激素和雌激素受體信號等的調控[26]，上述信號通路和關鍵分子可能為惡性腫瘤提供輔助診斷標志物和潛在的分子靶點。PI3K/AKT和Ras/MEK/ERK是參與調控多種細胞增殖最重要的兩條信號通路[27]。活化的AKT可通過調控多個下游關鍵信號節點，促進腫瘤細胞存活、增殖、生長和細胞代謝通路的改變[28]。

綜上所述，我們的研究結果表明，利用RNAscope原位雜交技術檢測的FGFBP2 mRNA表達有潛力作為食管癌患者的預后判斷分子標志物。同時，本研究揭示了FGFBP2通過AKT信號通路對食管癌細胞增殖的作用，為進一步深入研究食管癌的發生發展機制以及發現新靶點提供前期實驗基礎。