端粒蛋白復合物shelterin的結構及功能研究進展

王 晗，倪 娟，2，薛京倫，汪 旭，2，*

(1．云南師范大學生命科學學院，云南 昆明 650500；2．云南師范大學生物能源持續開發與利用教育部工程研究中心，云南昆明 650500；3．復旦大學生命科學學院，上海 200433)

端粒(telomere)位于真核生物線性染色體末端，是穩固真核生物染色體、保護遺傳信息完整的必要組分。端粒長度的調節對維持端粒結構及功能的穩定至關重要，也在維護染色體末端的完整性及穩定性方面起重要作用[1]。端粒縮短與衰老相關，而當細胞在端粒極短時繼續存活，則會引起端粒結構和功能紊亂，導致基因組不穩定性發生，增加疾病發生風險[2]。目前，端粒長度已成為退行性疾病如心血管疾病、阿爾茲海默癥、風濕性關節炎等的重要生物指標[3]。端粒酶(telomerase)、端粒蛋白復合物(shelterin)以及眾多與端粒相互作用的因子，均參與調控端粒長度。任何端粒相關蛋白因子表達改變均與端粒功能失調、細胞衰老加速相關，進而導致基因組不穩定性以及疾病的發生和發展[4]。

其中，shelterin復合物對端粒結構及功能的重要維護作用逐漸凸顯。近年來研究發現，shelterin復合物表達異常、蛋白質結構改變或發生基因突變，容易引起端粒脫帽、端粒長度改變，對端粒結構和功能產生嚴重影響，易引起染色體末端融合、基因組穩定性下降等惡性事件的發展，與疾病發生密切相關。Shelterin復合物各組分的結構及其端粒維護功能甚至非端粒功能的研究，對端粒生物學、端粒相關的退行性疾病研究均具有重要意義，也在癌癥早期診斷、干預和治療過程中具有潛在作用。本文對shelterin復合物的結構和各組分的功能研究進展進行綜述。

1 端粒蛋白復合物shelterin

在結構上，端粒序列由雙鏈DNA區和一個富含G的3′端懸突即單鏈DNA區組成。Shelterin復合物可通過與端粒特異性結合，使端粒末端類似DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand break，DSB)結構形成端粒環(telomere-loop，T-loop)，幫助端粒成帽，保護染色體末端免遭DSB識別，抑制DNA損傷應答(DNA damage response，DDR)，維護端粒結構和功能完整，保護染色體末端穩定[5]。人的shelterin復合物由6種核心蛋白質組成：端粒重復結合因子1和2(telomeric repeat-binding factors 1 and 2，TRF1，TRF2)，TRF1相互作用蛋白 2(TERF 1-interacting protein 2，TIN2)，TRF2相互作用蛋白1(TRF2-interacting protein 1，RAP1)，端粒保護蛋白1(protection of telomeres 1，POT1)以及POT1結合蛋白1(telomere-binding protein POT1-interacting protein 1，TPP1)[6]。其中，TRF1 和TRF2與端粒雙鏈DNA結合；TPP1與POT1結合后募集POT1到端粒區；POT1可特異性識別端粒單鏈DNA；RAP1通過與TRF2相互作用定位到端粒；最后，TIN2起到橋梁作用將POT1-TPP1與TRF1、TRF2連接，從而將整個shelterin復合物結合到一起，穩定端粒結構(圖1所示)。

Shelterin復合物可抑制端粒區包括ATM和ATR信號傳導、非同源末端連接、同源重組等介導的DNA損傷信號通路及DNA修復途徑激活，并通過螯合端粒3′端懸突來阻止外切核酸酶對端粒區的降解，它還可通過影響端粒酶到達端粒區的進程來調控端粒長度[8]。Shelterin復合物完成對端粒穩定維護的前提，必須是shelterin各組分的結構和功能完整。

2 TRF1和TRF2

圖1 端粒與shelterin復合物[7]

Shelterin的兩個亞基TRF1和TRF2均具有對端粒雙鏈DNA特異性結合的C端Myb-SANT DNA結合結構域、鉸鏈結構域和二聚化結構域，TRF2還具有RAP1結合基序[9]。TRF1和TRF2必須先構成同源二聚體，才能與端粒序列緊密結合。TRF2具有拓撲異構酶活性，可幫助端粒3′端懸突插入雙鏈DNA中形成T-loop，有效隱藏了端粒末端，它還負責端粒成帽，對保護端粒完整性至關重要[10]。

研究發現，TRF1最主要的作用是負向調控端粒長度[11]，并參與端粒DNA復制[12]。TRF1刪除會阻止ATM-TRF1相互作用，阻礙P53和CHK2募集，使DNA損傷區域的復制叉繼續前進，最終導致細胞分裂異常和基因組不穩定[13]。而TRF2可正向調控端粒長度，TRF2同源二聚體結構還可特異性抑制端粒區ATM依賴的DNA損傷信號，這個結構是許多修復蛋白如Apollo、SLX4、RTEL1的結合中心，TRF2的表達減少可激活端粒區ATM激酶通路，導致非同源末端連接引起的端粒融合[10，14-15]。端粒鋅指相關蛋白(telomeric zinc finger-associated protein，TZAP)可與TRF2競爭結合到端粒區來調控端粒長度，開啟并觸發端粒修剪(telomere trimming)，設定端粒長度上限，維護基因組穩定，但在TRF2過表達的細胞中定位到端粒區的TZAP會大大降低，說明TRF2過表達會取代TZAP的位置[16]。

細胞中TRF1和TRF2表達改變在癌癥發生、發展過程中出現。Diehl等[17]發現，TRF2表達下降引起端粒縮短，促使乳腺癌惡化。Pal等[18]發現，在腎細胞癌中，TRF1和TRF2的轉錄水平和蛋白水平均呈高表達狀態，而沉默TRF1和TRF2可引起腎癌細胞A498細胞周期阻滯，凋亡發生。TRF1和TRF2的表達狀況可能在腫瘤早期診斷中成為指標。

3 POT1和TPP1

POT1可高特異性、高親和性結合端粒單鏈DNA，在端粒區，POT1與TPP1會形成異源二聚體，并依賴POT1的寡核苷酸結合折疊(OB-fold)結構域結合到端粒3′端，阻止復制蛋白的募集，抑制端粒區類似DNA雙鏈損傷的激活[19]。人POT1有3個OB-fold結構域，它們負責與端粒DNA結合，并對POT1與TPP1相互作用構成緊密的異源二聚體非常重要。TPP1與POT1的結合，可提高POT1與單鏈DNA的緊密程度，促進POT1與端粒區單鏈DNA結合，保護染色體末端穩定[20]。TPP1的N端OB-fold結構域還可與端粒酶重要組分TERT相互作用，將端粒酶募集到染色體末端，并且與POT1一起增加端粒酶延伸活性，調節端粒長度[21]。

POT1還是癌癥中最常見的突變型shelterin組分。由于POT1抑制DNA損傷信號傳導和修復激活的能力均需要OB-fold的參與，所以有研究認為OB-fold突變促進了基因組不穩定性且可引發腫瘤[22]。Chen等[23]發現POT1 C端的A364E、P371T、E572K等突變位點可破壞POT1與TPP1結合，引起POT1蛋白改變，導致基因組不穩定性增加。Rice等[19]也發現POT1 C端的P446Q、C591W、Q623H等位點突變可擾亂POT1的C端折疊，或破壞POT1-TPP1結合及POT1-TPP1與端粒的親和力，導致基因組不穩定并促進如黑色素瘤等癌癥發生。

除基因突變外，POT1或TPP1刪除或表達改變，同樣與疾病產生相關。Qiang等[24]發現在利用ALT延長端粒的U2OS細胞中，TPP1刪除導致端粒縮短、凋亡發生和細胞輻射敏感性增強。Ahmad等[25]在吸煙者、肺氣腫和慢阻肺病患者中發現TPP1表達降低，并伴隨持續的端粒DNA損傷和細胞衰老，他們發現吸煙會破壞TPP1與去乙酰化酶的相互作用，導致TPP1乙酰化和蛋白降解增加。

4 TIN2

TIN2是POT1-TPP1復合物與TRF1、TRF2相連接的橋梁，也起到穩定TRF1、TRF2與雙鏈DNA連接的作用。研究發現，TIN2的異常會引起shelterin復合物不能完整組裝并緊密結合到端粒區。先天性角化不良(dyskeratosis congenita，DC)患者的統一特征是端粒異常縮短，Frescas等[26]研究證實攜帶TIN2突變的DC患者將具有更短的端粒且伴隨有疾病加重的現象。Chen等[27]在TIN2敲除的細胞中也觀察到TRF2功能的降低，在TIN2敲除的細胞中，過表達TRF2并不能完全抑制ATM激酶信號通路的激活，TRF2突變引起TIN2結合的改變也會引起ATM信號通路的部分激活。

除TIN2的端粒功能外，近幾年有研究發現了TIN2的非端粒功能。Sullivan等[28]發現，定位于線粒體的TIN2可減少ATP的產生并增加ROS的生成，而線粒體長期缺失TIN2會導致細胞代謝增殖加速，引起細胞增殖的異常，易誘導細胞癌變。

5 RPA1

抑制因子激活蛋白1(repressor/activator protein 1，RAP1)，是shelterin中保守度最高的組分。人RAP1包含4個蛋白質相互作用域：N末端的BRCT結構域，兩個中心Myb結構域以及C末端的RPA1蛋白相互作用即RCT結構域，其中，RCT結構域在RAP1與TRF2的相互作用中起關鍵作用[29]。RAP1通過與TRF2相互作用結合到端粒序列上，形成穩定的復合物，但其對端粒成帽卻是一個非必須蛋白[30]。即使如此，RAP1和TRF2之間的相互作用對端粒功能和染色體末端維護仍然重要[29]。Kabir等[31]發現在沒有Ku 70/80的情況下，RAP1-TRF2復合物可有效抑制染色體末端的同源性修復。Benarroch等[32]也發現在端粒保護機制受損時，端粒區RAP1可作為防止非同源末端連接的備用機制，保護端粒末端穩定。RAP1表達還與腎細胞癌相關[33]，RAP1通過其端粒相關作用穩固端粒結構，RAP1表達改變同樣可導致疾病發生。

6 展望

端粒結構和功能完整對基因組穩定性維持起重要作用，端粒異常與基因組不穩定性相關，容易增加疾病風險。大量研究已證實，shelterin復合物起到維持端粒穩定和調控端粒酶進程的重要作用，因shelterin復合物表達異常或結構改變引起端粒功能失調可推動癌癥發生、發展。目前，已發現通過抑制TRF1來誘導癌細胞端粒脫帽，進而引起端粒損傷以及細胞死亡，可將TRF1作為肺癌治療潛在靶點，同時，多種腫瘤中均發現TRF2、TPP1表達上調，也突出shelterin成員有希望作癌癥早期診斷、干預和治療的潛在靶點[34]，而檢測POT1的N端及C端突變位點也可在預防和治療癌癥中起到關鍵作用。任何shelterin復合物組分發生表達、結構改變，都將影響整個shelterin復合物與端粒區的穩定結合，因此shelterin組分精細結構及特定功能的全面深入研究，對清晰解讀端粒生物學、預防和治療癌癥等方面將有極大的促進作用。