miR-146a多態性與非小細胞肺癌易感性的研究

應 偉，王興遠，江 波，周 偉*

(廣安市人民醫院腫瘤科，四川 廣安 638000)

肺癌是全球癌癥死亡的主要原因，每年造成100多萬人死亡[1]，85%的病例為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)。NSCLC是一種上皮細胞惡性腫瘤，又分為腺癌、鱗狀細胞癌和大細胞癌[2]，究其病因主要有遺傳和環境因素[3-4]，遺傳因素中目前已經鑒定了一些NSCLC突變基因，如EGFR和KRAS[5-8]，但其確切的發病機制仍不清楚。近年來，隨著基因組研究的不斷發展，單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)與NSCLC的關系逐步被揭示[9]。包括微小RNA(miRNA)的SNP，miRNA屬于非編碼RNA，在轉錄后參與調節靶miRNA，可調節的基因多達人類基因的30%[10-12]。已有研究[13-14]發現一些miRNA與肺癌的風險和預后顯著相關。Takamizawa等[15]報告let-7 miRNA的低表達促進肺癌的進展，而Hayashita等[16]發現miR-17-92上調可能降低肺癌風險。在遺傳因素中miRNA SNP與肺癌的發生密切相關，可能是SNP可以改變miRNA的生物學功能，進而影響個體罹患癌癥的風險[17-19]。為此本文通過對四川廣安地區漢族人群miR-146a rs2910164 G/C基因多態性分析，探討其與非小細胞肺癌遺傳易感性的關系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集四川省廣安市人民醫院2016年3月—2018年3月收治入院的非小細胞肺癌患者，共采集198例患者的靜脈血標本作為病例組。納入標準：經病理學確診為原發性NSCLC、未進行抗癌治療、無腫瘤家族史，其中鱗癌81例、腺癌115例、腺鱗癌2例。排除標準：經檢查排除肺部占位性病變、無痰中帶血或血痰、胸痛等癥狀。對照組218例為同期醫院體檢的健康人群。

1.2 試劑與儀器

miR-146a引物和2×Taq PCR Master Mix(Qiagen生物科技有限公司)，標準酶試劑盒(英國RNADOX公司)，Gold View I型核酸染色劑(上海拜力生物科技有限公司)，Sac I-HF限制性核酸內切酶(Fermentas公司)，核酸提取試劑盒(北京莊盟國際生物基因科技有限公司)。DHG-9140A型鼓風干燥機(上海精宏實驗設備有限公司)，S21-6電熱恒溫水浴箱(上海博訊儀器公司)，可調微量移液器(德國Eppendorf公司)，ChemiDoc XRC凝膠電泳成像系統(美國Bio-Rad公司)。

1.3 標本采集

采用真空抗凝(EDTA)管采集空腹靜脈外周血3 mL，3 000 r/min離心10 min，收集血細胞，置于-80℃冷凍貯存、待檢。

1.4 基因型分析

采用酚-氯仿抽提法對血液樣本進行DNA提取，通過Nanodrop檢測其濃度后用PCR-限制性片段長度多態性(PCR-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)技術檢測基因型，miR-146a rs2910164基因的引物上游為5'-CATGGGTTGTTGTGTCAGTGTCAG AGCT-3'，下游為5'-AACCTTCTGACCTCTGTCTTCCG T-3'，PCR反應體系10 μL中含模板 DNA 1 μL，上游引物 2 μL，下游引物 2 μL，2×Taq PCR Master Mix 4 μL，去離子水4.6 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性34 min，94℃、30 s，58℃、30 s，72℃、1 min，35個循環；72℃ 延伸5 min。用Sac I-HF酶對PCR產物進行酶切，并置于37℃恒溫水浴4 h、取出進行電泳實驗及染色。最后基因型由2位研究者進行判讀，若判讀結果不一致時，則重新檢測1次。隨機抽取10%的樣本進行測序驗證。

1.5 統計學方法

運用SPSS 20.0統計軟件，計算基因型的頻率及是否符合Hardy-Weinberg平衡。單因素及多因素Logistic回歸分析，計數資料采用單因素χ2檢驗，計量資料采用t檢驗和比值比(OR)計算風險比例與95%可信區間(confidence intervals，CI)。均以雙側α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 研究對象一般資料

病例組和對照組在性別、年齡的分布差異無統計學意義(P>0.05)，吸煙在兩組間的差異有統計學意義(P<0.01)，見表1。

表1 對照組與病例組人群一般資料的比較

2.2 rs2910164酶切結果

rs2910164被酶切成 GG、GC、CC基因型(圖1)，CC基因型為122和25 bp 2條帶；GC基因型為147、122和25 bp 3條帶；GG基因型為147 bp和25 bp 2條帶；3種基因型中25 bp條帶均未顯示。

圖1 rs2910164酶切后電泳圖

2.3 rs2910164基因分型與測序

GG、GC、CC分型在對照組分別為103例(47.25%)、85例(38.99%)、30例(13.76%)；在病例組分別為 31 例(15.66%)、99 例(50.00%)、68 例(34.34%)。隨機抽取10%的樣本進行DNA測序，見圖2。其結果與PCR-RFLP分型結果一致，基因分型頻率滿足Hardy-Weinberg遺傳平衡(P>0.05)。

2.4 rs2910164基因型與非小細胞肺癌發病風險的關系

不同基因模型下的Logistic回歸分析結果見表2。CC基因型顯著增加非小細胞肺癌的發病風險[OR(95%CI)為7.26(6.69，7.87)]，差異具有統計學意義(P<0.01)，校正性別、年齡、吸煙因素后OR(95%CI)為6.82(6.28，7.41)，差異亦具有統計學意義(P<0.01)。顯性基因模型中GC/CC可使非小細胞肺癌的患病風險增加5.14倍，校正混雜因素后OR(95%CI)為5.04(4.72，5.39)，差異具有統計學意義(P<0.01)。隱性基因模型中，CC基因型罹患非小細胞肺癌的風險是GG/GC基因型的2.94倍，校正性別、年齡、吸煙因素后差異仍有統計學意義(P<0.01)。等位基因模型中C等位基因明顯增加人群罹患非小細胞肺癌的風險，OR(95%CI)為2.92(2.21，3.89)，差異具有統計學意義(P<0.01)。

圖2 rs2910164基因測序結果

表2 rs2910164基因型與非小細胞肺癌風險的關系

2.5 rs2910164與非小細胞肺癌臨床特征之間的關系

在病例組中，根據不同的腫瘤特征進行分組(表3)，采用Logistic回歸分析顯性基因模型與非小細胞肺癌臨床特征的關系。通過校正吸煙、性別、年齡等因素，各個基因模型與非小細胞肺癌病理類型、臨床分期、淋巴結轉移之間無明顯相關性，差異均無統計學意義(P>0.05)。

表3 rs2910164與非小細胞肺癌臨床特征之間的關系

2.6 基因-環境的交互分析

采用非條件Logistic回歸“后退法”，在校正性別、年齡的前提下，將吸煙納入回歸模型。結果顯示rs2910164 GC和CC基因型與吸煙之間無交互作用(β=-0.048，P=0.520；β=-0.145，P=0.088)。見表4。

表4 吸煙與基因型的交互作用

3 討論

miR-146包括miR-146a、miR-146b，其中miR-146a位于人類5號染色體loc285628的外顯子區域，具有較高的穩定性和保守性，并在轉錄后通過與靶基因集合參與多種生物學過程(包括免疫、炎癥、腫瘤等)[20-21]。在參與腫瘤發生發展的過程中，可能是由于rs2910164 G到C等位基因的突變導致G∶U與C∶U之間的錯配，使得成熟miR-146a的產生與表達受到影響[22]，含有C等位基因miR-146a前體的轉錄活性較低，最終影響miR-146a與靶mRNA的結合[23]，進而影響了個體罹患腫瘤的風險。

迄今為止，有關miR-146a rs2910164基因多態性在腫瘤發生風險中的研究較多，但存在諸多的不一致。例如，雜合子基因型GC可增加人群罹患甲狀腺乳頭狀癌的風險[24]；Shen等[25]研究發現C等位基因可增加人群罹患家族性乳腺癌的風險；Xu等[26]發現CC基因型可降低罹患前列腺癌的風險；Jeon等[27]報道攜帶CG/GG基因型的個體與韓國人群中的CC基因型相比，肺癌發生風險明顯降低。Xiao等[28]通過對6篇病例-對照研究進行Meta分析發現，miR-146a rs2910164 CC基因型與GG基因型相比可增加人群罹患肺癌的風險；Fang等[29]研究發現肺癌病例組中CC基因型、C等位基因較正常對照組中明顯增多；Vinci等[30]發現rs2910164 GC基因型可顯著增加非小細胞肺癌的發生風險。上述研究結果表明rs2910164基因多態性與腫瘤的易感性之間存在明顯的差異性。本次研究表明，廣安地區漢族人群miR-146a rs2910164基因多態性C等位基因可增加人群罹患非小細胞肺癌的風險，攜帶GC/CC基因型的個體患肺癌的危險性增加5.04倍。

研究[13-14]表明miRNA與肺癌的風險和預后顯著相關，為進一步探討rs2910164基因多態性與NSCLC臨床特征之間的關系，本研究通過顯性基因模型下的不同特征分析，并未發現rs2910164基因多態性與NSCLC的臨床特征有關聯。綜上所述，本研究發現rs2910164 C等位基因可增加人群罹患NSCLC的風險，但由于SNP在不同種族、人群、生活環境等的差異，在未來仍需要進一步的大樣本、多中心的研究加以驗證。