乳腺癌易感基因1調控氧化損傷在神經退行性疾病中作用的研究進展

梁 辰，靳翠紅*

(中國醫科大學公共衛生學院衛生毒理學教研室，遼寧 沈陽 110122)

神經退行性疾病是一種異質性疾病，其特征性改變在于神經系統慢性進行性認知功能的喪失。大腦和脊髓的細胞由神經元組成，神經元功能包括：控制運動、處理感覺信息、作出決策。由于神經元細胞不會再生，所以損害不可逆轉。典型的神經退行性疾病包括：阿爾茲海默病(Alzheimer’s disease，AD)、帕金森氏病(Parkinson’s disease，PD)、亨廷頓氏病(Huntington’s disease，HD)等。隨著生活水平的逐步提高，以及社會人口老齡化程度的不斷加劇，AD、PD、HD患病人數逐年增多。神經退行性疾病的病情呈慢性不可逆性進行性加重，給社會和家庭帶來了極大的負擔。氧化應激導致的特定區域神經細胞功能紊亂是神經退行性疾病的重要發病機制。因此，闡明氧化損傷與神經退行性疾病的關系，及其可能的發病機制，對提高老年人的生命質量和壽命具有重要的理論和實際意義。

1 氧化損傷與神經退行性疾病

研究發現，神經退行性病變早期可檢測到的事件之一就是DNA(主要是mtDNA)氧化性損傷，導致線粒體功能障礙，使神經元的氧化應激永久化，最終導致神經退行性病變。

由于機體腦組織耗氧量大、不飽和脂肪酸含量高、抗氧化酶含量低，導致腦組織極易受活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)攻擊，引發氧化損傷[1]。研究證實，神經元DNA氧化損傷與認知缺陷密切相關，且在各種神經退行性疾病病理改變的早期發生[2]。當發生氧化損傷時，ROS產生過多，電子傳遞鏈(electron transport chain，ETC)復合物1、2、4的活性降低[3]。ETC功能障礙可能導致線粒體損傷。

AD是全球癡呆病中最常見且發病率最高的癡呆類型。有研究表明，AD患者腦中線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)的氧化修飾有所增加，且在其皮質mtDNA中觀察到8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy-deoxyguanosine acid，8-OHdG)水平升高[4]。最近在AD患者腦中發現了由尿嘧啶DNA糖苷酶(UDG)，8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶(OGG1)和DNA聚合酶活性降低引起顯著的堿基切除修復(base excision repair，BER)功能障礙[5]。BER缺陷存在于AD患者的受累腦區以及未受影響的腦區，表明BER損傷是AD大腦的一般特征。

有大量文獻支持線粒體功能障礙和氧化損傷在AD發病中的作用，即AD早期，大腦組織病理改變發生前已產生氧化損傷[6]。進一步的研究表明，mtDNA可能參與了AD的線粒體功能障礙。當患者mtDNA被轉移到mtDNA缺陷細胞系時，由此產生的“胞質雜種”細胞重現了AD中腦和其他組織中所見的呼吸酶缺陷，表明這種缺陷至少部分是由mtDNA異常引起的[7]。

PD是第二常見的神經退行性疾病。ETC酶復合物I缺陷引起的線粒體功能障礙可能參與PD發病過程[8]。實際上，用于制作PD實驗模型的線粒體毒素通常會破壞電子傳輸系統的能力，并以這種方式促進氧化應激[9]。PD患者黑質致密區(substantia nigra pars compacata，SN)的神經元細胞質8-OHdG免疫反應強烈，外周血淋巴細胞DNA氧化損傷(DNA單鏈斷裂和氧化嘌呤堿基)及尿中8-OHdG水平更高。因此，認為線粒體損傷和細胞氧化狀態失衡是PD發生和發展的重要因素[10]。

HD以常染色體顯性方式遺傳，致病原因是亨廷頓蛋白(Huntingtin，Htt)異常。HD是Htt基因的氨基末端編碼區中胞嘧啶、腺嘌呤和鳥嘌呤(CAG)三核苷酸重復序列異常擴增，導致相應蛋白中的N-末端聚谷氨酰胺表達異常[11]。HD動物模型研究發現3-硝基丙酸(3-nitropro pionic acid，3-NPA)腹腔注射能夠引起線粒體復合物II的抑制，3-NPA是一種不可逆的琥珀酸脫氫酶抑制劑，這表明氧化應激可能在HD的發病中發揮重要作用[12]。

2 乳腺癌易感基因1

乳腺癌是影響女性健康的主要惡性腫瘤之一。乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1)是與乳腺癌發病相關的重要基因，是腫瘤抑制因子，參與維持基因組穩定性，其突變是造成大多數遺傳性乳腺癌的原因。BRCA1突變發生乳腺癌的風險概率為80%[13]。

BRCA1基因位于染色體17q21.3，包含193 689個核苷酸，共有24個外顯子。其中外顯子11是核心外顯子，編碼超過整個蛋白質的60%[14]。BRCA1蛋白全長1 863個氨基酸，220 kD，是一種多結構域蛋白，有4個主要結構域：RING、BRCT、P300/CBP和卷曲螺旋(見圖1)。其中RING結構域和BRCT結構域尤為重要。RING結構域與BRCA1相關環狀蛋白(BRCA1 associated RING domain protein，BARD1)相互作用時，顯示E3連接酶活性。RING結構域突變使其從BARD1脫離，E3連接酶活性消除，通常與癌癥易感性相關。BRCT結構域是BRCA1羧基末端重復序列，其識別磷酸-SXXF基序中的磷酸化絲氨酸并結合3種蛋白，分別是帶有pSPxF結構的磷酸化蛋白Abraxas，DNA解旋酶BRIP1和DNA修復酶CtIP。BRCT結構域與DNA損傷應答蛋白質相互作用，修復DNA損傷[15]。在RING和BRCT結構域發現了許多遺傳性BRCA1突變，表明這些結構域對于BRCA1的功能至關重要。P300/CBP結構域可與P300、CREB相互作用，發揮轉錄調節活性。卷曲螺旋結構域在同源重組中起作用[16]。

圖1 BRCA1蛋白的結構域

在功能方面，BRCA1是抑癌基因，參與細胞內多種代謝過程[17]。BRCA1可修復DNA損傷，在DNA損傷中，DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand break，DSB)是最嚴重的損傷形式，會導致染色體重排、腫瘤發生和細胞死亡等[18]。DSB有2種修復途徑：同源重組(homologous recombination，HR)和非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)。BRCA1是調控HR修復DSB的重要蛋白。相關研究證明除具有抑制惡性腫瘤發生的作用外，BRCA1蛋白在DNA損傷修復、細胞周期、基因轉錄調節、細胞凋亡等過程中發揮著重要的生物學功能[19]。

3 BRCA1調控氧化損傷的機制

3.1 BRCA1調控氧化損傷與基因組穩定性

基因組是指細胞內所有遺傳信息，這種遺傳信息以核苷酸序列形式存儲。在機體內，基因組包括細胞核DNA(nuclear DNA，nDNA)和mtDNA，分別是細胞核和線粒體中的遺傳物質。

mtDNA編碼37個基因，其中大多數為ETC的必需蛋白[20]。mtDNA是獨立于細胞核染色體外的基因組，由于以下3個原因：靠近氧化代謝部位——線粒體內膜，局部ROS高水平；缺乏保護性組蛋白；損傷修復途徑不完善，主要依賴于BER途徑，故mtDNA比nDNA對氧化劑更敏感，更易受到氧化損傷。因此，mtDNA積累的突變也遠高于nDNA[21]。mtDNA突變或損傷會引起編碼的呼吸鏈復合物活性下降，使得線粒體功能障礙，ATP生成減少，ROS產生增加。當不能及時修復mtDNA損傷時，則可能引起線粒體功能障礙和病理狀態，進而導致機體衰老、腫瘤以及神經退行性疾病的發生。

基因組不穩定是腫瘤發生和神經退行性疾病一個重要的共同特征[22]。BRCA1與DNA損傷應答的相關研究發現，BRCA1在維持基因組完整性方面發揮重要作用。BRCA1在散發性乳腺癌和卵巢癌中表達降低或缺失，而且在非遺傳性腫瘤中也起著腫瘤抑制基因的作用。BRCA1基因突變亦會增加前列腺癌和胰腺癌的患病風險[23]。在BRCA1缺陷(功能喪失或基因突變等)細胞中，存在DNA的損傷修復缺陷和基因組不穩定性現象。這種基因組的不穩定可能會引起基因組的永久致癌性或神經退行性改變[24]。

3.2 BRCA1調節DNA修復

生物體進化過程中形成了多種修復系統，對不同類型的損傷進行不同的修復，以保持基因組精確性和穩定性。研究認為，BRCA1參與調控3種DNA修復途徑：BER、HR、NHEJ[25]。BRCA1通過刺激8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶OGG1、DNA糖基化酶NTH1、嘌呤核酸內切酶氧化還原因子1/嘌呤核酸內切酶1(REF1/APE1)等BER關鍵酶在人乳腺癌細胞MCF-7中的表達，從而促進BER途徑[26]；OGG1、NTH1和REF1/APE1這3種酶都有助于BRCA1抵制由過氧化氫(H2O2)引起的氧化應激，H2O2能夠促進這3種酶和BRCA1的表達。他們的研究結果確認了BRCA1可能調控DNA氧化損傷的一種新的機制[25]。

BRCA1也直接參與HR修復DSB。在應答DSB時，BRCA1會與受體相關蛋白80(receptor-associated protein 80，RAP80)形成BRCA1-RAP80復合物結合到DSB部位，促進DSB 5′端的切除，啟動HR[27]。NHEJ不使用同源模板，而把幾乎任何類型的DSB末端直接連接到一起，因此它可以發生于細胞周期任何階段，在G1期占優勢，研究發現在G1期BRCA1促進了NHEJ的發生[28]。當DSB發生時，BRCA1可以同ATM/ATR和傳感器蛋白(MRN或Rpa)激活的磷酸化γ-H2AX形成復合物，并招募HR或NHEJ進行DNA的修復。如果損傷達到一定水平，則BRCA1充當ATM/ATR和Chk1/Chk2之間的適配器，在細胞周期中建立朝向檢查點的級聯，以便于DNA修復。如果損傷過重，細胞則發生凋亡[29]。

3.3 BRCA1調控轉錄因子Nrf2

BRCA1可誘導抗氧化劑應答基因的表達，保護細胞免受氧化應激的損害。多個研究提示BRCA1本身可以調節氧化應激：BRCA1缺失會增加細胞ROS水平，而BRCA1過度表達則抑制ROS的產生[26]。Nrf2-ARE是機體重要的抗氧化通路。Nrf2結合到靶基因啟動子的ARE元件，誘導抗氧化酶基因的表達，從而抵抗化學致癌物以及修復ROS所致DNA損傷，進而保護正常細胞、抑制癌變，預防DNA氧化損傷的發生[30]。

研究發現BRCA1可促進Nrf2靶基因表達，且這種激活作用依賴于Nrf2啟動子的存在，提示Nrf2在BRCA1信號通路下游，BRCA1通過調控Nrf2來促進抗氧化反應酶基因的轉錄表達，從而保護細胞免受ROS損害[31]。已有報道[32]發現化學防癌劑吲哚-3-甲醇(I3C)，及其代謝物二吲哚甲烷(DIM)可以促進BRCA1表達并激活Nrf2-ARE信號通路，但抑制BRCA1表達后，這種激活作用下降明顯，說明DIM對Nrf2-ARE信號通路的激活依賴BRCA1的存在，故推測BRCA1可能介導Nrf2-ARE信號通路的激活。此外，BRCA1還可以抑制Nrf2的泛素化經降解[31]。

3.4 BRCA1調節細胞其他功能

BRCA1是一種多功能蛋白質，參與調控細胞周期、凋亡和各種轉錄途徑以及DNA損傷信號傳導和修復[34]。作為BRCAFanconi貧血癥途徑的一個組成部分，BRCA-Fanconi功能喪失導致細胞對DNA損傷劑的敏感性增加，細胞周期檢查點缺陷和癌癥易感性。BRCA1對直接修復和/或依賴其他補償性修復DNA損傷必不可少[34]。BRCA1與BARD1一起發揮E3泛素連接酶功能，是BRCA1唯一已知的酶功能[35]。此外還有研究表明BRCA1單倍體不足導致參與細胞增殖和發育的43個基因表達改變，可能影響分化，從而使細胞更容易趨于惡化[36]。

4 BRCA1與神經系統功能

保持DNA完整性對于所有細胞和生物體均至關重要。DNA損傷和/或修復缺陷可能導致神經退行性疾病。Suberbielle等[37]發現，AD病人和人淀粉樣前體蛋白(human amyloid precusor protein，hAPP)轉基因小鼠大腦中BRCA1表達水平下調；β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)寡聚物處理可下調原代神經元中BRCA1的表達水平；小鼠海馬DG區BRCA1沉默可增加DNA雙鏈斷裂、神經元固縮、突觸可塑性受損、學習記憶缺陷，而APP/Aβ過表達可加重這些效應。此研究證實BRCA1與AD認知障礙密切相關。有研究發現鋁暴露正常乳腺上皮MCF10A細胞可引起BRCA1 mRNA和蛋白的下降[38]。此外，AD中氧化性DNA損傷譜的證據提示BRCA1可能在神經退行性疾病的發病機制中發揮重要作用[39]。

研究發現，BRCA1對Aβ誘導的DNA雙鍵斷裂具有保護功能[37]。因死亡后細胞的降解和腦內細胞的復雜性限制了從分子層面闡明AD病理特征和神經功能障礙的因果關系，故有研究[40]應用AD患者死后大腦樣本，分析其神經元特異性基因組DNA甲基化譜，確定了BRCA1啟動子上有差異的低甲基化區域，而且發現BRCA1在AD腦中表達顯著上調。同時，在體外細胞和小鼠模型中均發現，BRCA1在細胞質中定位錯誤會導致DNA雙鏈斷裂。Aβ負荷下BRCA1的功能障礙伴隨著基因組完整性和突觸可塑性下降。另外，模型小鼠腦中BRCA1啟動子區呈低甲基化狀態，提示BRCA1在AD中調控的一種表觀遺傳機制。上述研究均證實DNA完整性喪失是AD發病機制中的核心因素[40]。

有研究提出，觀察到的神經元中活性磷酸化BRCA1的表達水平增強可能在AD細胞死亡信號傳導中發揮重要作用，其過度激活可能先于最終的神經元丟失和BRCA1耗盡，研究還提出BRCA1上調在不同神經發育階段具有不同的含義，在神經元前體，成熟健康神經元和成熟AD神經元中發揮不同的作用[41]。在神經元中，情況可能很特別。氧化應激狀態下，神經元開啟細胞周期的進展以便存活，進而發生有絲分裂突變和最終的細胞凋亡信號傳導。由于BRCA1參與DNA修復，細胞周期暫停和細胞凋亡，隨著AD和神經變性的進展，BRCA1的表達水平增加。實際上，BRCA1蛋白的表達可能在AD進展的早期被激活，即細胞周期的變化在疾病進展的早期發生。總之，BRCA1的功能障礙可能比Aβ等AD中已知的病理因素早得多[41]。

上述研究提示，BRCA1可以保護神經元基因組，維持神經元完整性和認知功能。下調BRCA1的表達可造成氧化應激而影響認知功能，進而引發神經退行性疾病。

5 小結

DNA氧化損傷是所有神經退行性疾病的早期病理事件。腫瘤抑制因子BRCA1在神經細胞中也可能發揮重要的調控作用，參與DNA氧化損傷修復及其他相關修復途徑，與神經退行性疾病關系密切。研究BRCA1的調控作用有助于闡明神經退行性疾病的發病機制，并將為尋找潛在的神經系統退行性疾病的治療和早期干預的靶點提供重要依據和線索。