ROCK1基因敲除對乳腺癌細胞系遷移及侵襲的影響

王曉杰，滕 宇，顧 勐，王子宇，趙曉婷，岳文濤*

(1．首都醫科大學附屬北京胸科醫院/北京市結核病胸部腫瘤研究所細胞生物學研究室，北京 101149；2．首都醫科大學附屬北京婦產醫院中心實驗室，北京 100026)

乳腺癌(breast cancer)是全球最常見的女性腫瘤[1]，是女性癌癥死亡的主要原因，約11%的乳腺癌發生在中國，而且近幾十年來發病率及死亡率迅速上升[2]，其發生發展機制涉及諸多腫瘤相關基因的異常表達。事實上，在臨床表現之前，腫瘤細胞轉移性播散的最主要事件是細胞遷移，這也是腫瘤細胞轉移過程的核心[3]。大多數乳腺癌患者死于多器官轉移的晚期，是臨床治療失敗的主要原因。Rho相關蛋白激酶(Rho-associated protein kinase，ROCK)大約在20年前首次被發現在細胞遷移中起作用[4]，它參與了幾乎所有的遷移模式[5-6]。ROCK通過增強腫瘤細胞的侵襲性和運動性而顯著促進轉移[6-7]。因此Rho/ROCK通路通過調節肌動蛋白細胞骨架重組參與腫瘤發展進程。已有研究[8-9]報道，特定的ROCK抑制劑可以抑制腫瘤的生長和轉移。ROCK1是小型G蛋白GTPase RhoA的下游效應物，通過肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC)的磷酸化調節細胞的運動，從而促進應力纖維的形成，增強細胞的運動和遷移能力[10]。由此可見，ROCK1可能在腫瘤細胞遷移、侵襲中發揮作用。但在各種腫瘤中的作用和相關機制還有待明確。

本研究中，我們通過成簇規律間隔的短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9，CRISPR/Cas9)[11]技術在MCF-7乳腺癌細胞系中構建穩定的ROCK1基因敲除細胞模型，為后續鑒定ROCK1直接調控的靶基因，研究其參與乳腺癌細胞侵襲轉移的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

Oligo引物(Generay Biotech)，2×Taq Plus Master Mix(Vazyme P212-03)，BsmB I(賽默飛)，T4 DNA 連接酶(Fermentas EL0016)，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和無內毒素質粒小提中量試劑盒均購自TIANGEN公司，胰蛋白胨和瓊脂粉均購自OXOID公司，嘌呤霉素和瓊脂糖購自Sigma公司，DTT二硫蘇糖醇(Sangon D0281-5g)，胎牛血清和RPMI-1640培養基購自Gibco，引物、TOP10感受態、ROCK基因敲除慢病毒、Polybrene感染增強劑均購自Genechem公司，人乳腺癌細胞系MCF-7源自醫學科學院基礎所細胞資源中心，ROCK1兔源單抗和HRP標記的GAPDH單抗購自Abcam公司。

主要儀器包括：電泳儀(Tanon EPS-600)，Alpha凝膠成像分析系統(FluorChemTMSP)，搖床(華利達實驗設備公司HI-9211K)，GHP-9080隔水式恒溫培養箱(上海一恒科學儀器有限公司)，PCR儀(Applied Biosystems 2720 thermal)，高速離心機(Thermo cycler 17)，微型掌式離心機(GeneSci mini-6k)。

1.2 質粒構建

針對目的基因靶基因序列，設計向導RNA(small guide RNA，sgRNA)靶點序列，靶點序列分別為LVROCK1-sgRNA-1(ATCCGAATTCACTTCCGATT)、LVROCK1-sgRNA-2(CTTCATAGCATATACCTTCC)、LVROCK1-sgRNA-3(TTAGGATGGATTGGATGCTT)及對照病毒LV-NC的隨機序列(CGCTTCCGCGGCCCGT TCAA)。載體兩端BsmB I酶切位點序列如下：CACCGGAGACGCGTCTCT/GTTT，GTGGCCTCTGCG CAGAGACAAA/(斜線表示酶切產生的黏端，方向相同的斜線對應雙鏈的互補堿基，下劃線表示互補序列)，設計原理為在sgRNA兩端加入BsmB I位點切割后產生的互補黏端，對GV392載體進行酶切，使其線性化，反應體系：GV392質粒(1 μg/μL)2 μL，10×酶切緩沖液 2 μL，DTT(20 mmol/μL)1 μL，BsmB I酶 1 μL，ddH2O補至20 μL；反應條件：37℃酶切3 h。由引物合成公司合成單DNA oligo(PAGE純化)，線性化的載體DNA與退火的DNA雙鏈進行連接，連入Lenti-CAS9-sgRNA-tag載體(Puromycin耐藥標簽)。反應體系及條件如下：線性化的載體DNA(50 ng/μL)2 μL，退火的雙鏈DNA 0.5 μL，10×T4緩沖液1 μL，pEG4000 1 μL，T4 DNA 連接酶1 μL，ddH2O補足至10 μL；16℃反應3 h。將連接好的產物冰浴30 min后轉化TOP10感受態細胞，吸取適量菌液均勻涂布在Amp抗性的LB固體培養基上，37℃恒溫箱中倒置培養過夜，次日進行菌落PCR鑒定。菌落PCR得到陽性克隆后測序，從而得到序列正確的表達sgRNA的過表達慢病毒質粒。

1.3 重組質粒的鑒定

在超凈工作臺中，以無菌吸頭挑取單個菌落至微型管中進行PCR鑒定，反應體系為：上游引物(10 μmol/L)0.5 μL，下游引物(10 μmol/L)0.5 μL，2×Taq Plus Master Mix 10 μL，模板菌落，ddH2O補足至20 μL。擴增循環反應條件為94℃、30 s，55℃、30 s，72℃、90 s，共22個循環。上游引物序列采用質粒共有序列：5'-CCATGATTCCTTCATA TTTGC-3'，即 Primer(+)；下游引物序列采用sgRNA的oligo序列(5'-CGCGTGGATAACCGTATTAC-3')為反義鏈，即Primer(-)，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，將陽性菌落接種于200 μL含氨芐抗性的LB培養基中，37℃振蕩培養2 h，取適量菌液進行測序，測序結果與設計的靶點序列進行比對分析。

1.4 慢病毒感染及細胞模型的篩選

人乳腺癌細胞系MCF-7培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中。感染前一天，消化MCF-7細胞，調整細胞濃度至3×104個/mL，每孔200 μL接種至96孔板。次日根據預實驗確定合適的病毒復數(multiplicity of infection，MOI)值，用含有感染增強劑聚凝胺的細胞培養基稀釋病毒，每孔加入100 μL病毒稀釋液感染上述乳腺癌細胞，感染8 h后更換常規培養基，培養72 h后，換成含嘌呤霉素(3 μg/mL)的培養基繼續培養48 h，對病毒感染細胞進行篩選，最終獲得慢病毒感染且穩定敲除ROCK1基因的目的乳腺癌細胞株。

1.5 Western blot檢測

將細胞株擴大培養，并分別收集穩定敲除ROCK1基因的乳腺癌細胞株、MCF-7親本細胞以及陰性對照組細胞(LV-NC)，加入適量混勻的蛋白裂解液。蛋白裂解液的配制比例為每100萬細胞內加入100 μL RIPA裂解液、1 μL cooktail、1 μL膽堿脂酶抑制劑PMSF以及二硫蘇糖醇(DL-dithiothreitol，DTT，稀釋1 000倍使用)，充分震蕩，12 000 r/min 4℃離心15 min，取上清液經BCA蛋白定量檢測法測定樣品濃度，按照與上樣蛋白體積1∶4的比例加入含β-巰基乙醇的5×上樣緩沖液，混勻后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳結束，經恒流電泳轉移、5%脫脂牛奶封閉、兔源一抗孵育、辣根過氧化物酶標記的二抗孵育、0.1%TBST洗膜、ECL化學發光等步驟，在Alpha凝膠成像分析系統(FluorChemTMSP)中曝光圖像并分析結果。

1.6 劃痕實驗

將處于對數生長期的穩定敲除ROCK1基因的乳腺癌細胞株及對照組細胞株用胰酶消化后計數，接種于6孔板，接種數量以次日鋪滿6孔板一層為宜。接種24 h后，在6孔板中劃痕，生理鹽水沖洗3次，更換含有0.2%牛血清白蛋白(albumin from bovine serum，BSA)的DMEM培養基，分別于劃痕后0、12、24 h觀察細胞的遷移情況并拍照記錄，實驗重復3次。

1.7 Transwell實驗

不鋪膠：將處于對數期的穩定敲除ROCK1基因的乳腺癌細胞株及對照組細胞株接種于25 cm2的細胞培養瓶，24 h后換成含有0.2%BSA的DMEM培養基培養過夜，另將小室置于24孔板中，上室中加入100 μL含有0.2%BSA的DMEM培養基，下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養基平衡過夜。次日消化，計數細胞，調整細胞濃度為5×105個/mL，取100 μL加入上室。24 h后用2%龍膽紫將小室染色30 min，洗凈，將小室的膜取下，封片拍照。

鋪膠：將小室置于24孔板中，上室中加入50 μL含有0.2%BSA的DMEM培養基經1∶5稀釋的基質膠，37℃溫箱過夜。次日，在上室中加入100 μL含有0.2%BSA的DMEM培養基，下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養基，水化30 min后加入100 μL細胞稀釋液(5×105個/mL)，48 h后用2%龍膽紫將小室染色30 min，洗凈，將小室的膜取下，封片拍照，其余步驟同上。

1.8 統計學分析

每項實驗均至少獨立重復3次；應用SPSS 16.0統計學軟件對數據進行分析，圖像分析所得相對灰度值以xˉ±s表示，兩樣本均數之間采用配對t檢驗進行比較。以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 ROCK1質粒的構建與鑒定

針對目的基因靶基因序列，設計sgRNA靶點序列，單鏈DNA oligo兩端含酶切位點黏端，經退火處理形成雙鏈DNA，連入Lenti-CAS9-sgRNA-tag載體(GV392、Puromycin藥物篩選標記，圖1A)。將連接好的產物使用TOP10感受態轉化，菌落PCR得到陽性克隆后測序，從而得到序列正確、表達sgRNA的過表達慢病毒質粒，然后進行慢病毒的包裝。LV-ROCK1-sgRNA-1(圖 1B)、LV-ROCK1-sgRNA-2(圖 1C)和 LVROCK1-sgRNA-3(圖1D)的質粒測序結果正確。

2.2 穩定敲除乳腺癌細胞株中ROCK1的鑒定

為檢驗ROCK1基因敲除后，細胞株中ROCK1蛋白的表達情況，對LV-ROCK1-sgRNA-1/2/3和陰性對照(LV-NC)及未經感染的MCF-7細胞進行Western blot檢測(圖2)。在被LV-NC感染的對照組細胞及親本細胞MCF-7中檢測到特異性ROCK1蛋白條帶，分子量約165 kD，在LV-ROCK1-sgRNA-1、LV-ROCK1-sgRNA-2感染的MCF-7細胞的對應位置可見到明顯減弱的蛋白條帶，而在LV-ROCK1-sgRNA-3感染的MCF-7細胞對應位置未見到明顯蛋白條帶，表明ROCK1敲除乳腺癌細胞模型構建成功。后續研究使用LV-ROCK1-sgRNA-3敲除ROCK1基因的細胞模型作為實驗組；LV-NC感染的細胞作為對照組。

2.3 ROCK1敲除對MCF-7細胞遷移和侵襲能力的影響

劃痕實驗結果見圖3。ROCK1敲除細胞株24 h劃痕愈合度為(60.600±0.047)%，對照組細胞24 h劃痕愈合度為(80.404±0.018)%，提示ROCK1敲除細胞株在24 h內劃痕愈合面積較對照組明顯降低，差異有統計學意義(P=0.003)。

圖1 ROCK1質粒的構建與鑒定

圖2 MCF-7細胞中敲除ROCK1的表達情況

Transwell結果見圖4。結果顯示在不鋪膠情況下，實驗組ROCK1敲除細胞株在24 h的遷移細胞數為(448.3±5.5)個，對照組的遷移細胞數為(271.3±5.0)個，提示ROCK1敲除細胞株在24 h內穿過小室底膜的細胞數與對照組相比明顯降低，差異有統計學意義(P=0.001)。提示ROCK1敲除可明顯抑制乳腺癌細胞MCF-7的遷移能力。

圖3 劃痕實驗結果及分析

圖4 Transwell實驗結果及統計分析

在鋪膠情況下，實驗組中ROCK1敲除細胞株48 h內的遷移細胞數為(1.7±2.9)個，對照組的遷移細胞數為(298.3±5.7)個，提示ROCK1敲除細胞株在48 h時內穿過基質膠的細胞數較對照組明顯降低，差異有統計學意義(P=0.001)。說明ROCK1敲除可明顯抑制乳腺癌MCF-7細胞的侵襲能力。

3 討論

乳腺癌患者的死亡率呈逐年上升的態勢，腫瘤轉移是大多數癌癥患者死亡的主要原因[12]。腫瘤細胞的侵襲與轉移是腫瘤轉移過程的核心環節。小GTPase Rho家族通過調節細胞形態、生長和運動的功能在腫瘤的侵襲與轉移過程中起著關鍵作用。ROCK1作為小型GTPase Rho家族主要的下游效應物，是激活Rho的主要介體，也是促進乳腺癌進展過程的重要因素[13-17]。Bottino等[14]用免疫組化的方法對乳腺癌腫瘤碎片中的ROCK1進行染色，結果發現有淋巴結轉移的腫瘤組織中ROCK1蛋白含量遠高于無淋巴結轉移者，ROCK1蛋白的表達量與臨床分期及有無遠處轉移也密切相關。除乳腺癌外，Vigil等[15]的研究表明，ROCK1作為非小細胞肺癌侵襲及轉移的重要因素，可以作為治療非小細胞肺癌的重要靶點。Sahai等[16]研究表明Rho GTPases調節細胞骨架和細胞遷移，在腫瘤中過表達，ROCK1也是其他癌癥[17]細胞運動/侵襲的關鍵因素。

本研究利用CRISPR/Cas9技術，應用乳腺癌細胞株MCF-7構建ROCK1敲除細胞模型，通過DNA測序和Western blot證實ROCK1基因敲除細胞模型構建成功，進一步通過細胞表型實驗研究ROCK1敲除細胞模型對乳腺癌細胞侵襲和遷移能力的影響。在用Western blot驗證細胞模型是否構建成功的結果中(圖2)，被LV-ROCK1-sgRNA-1或LV-ROCK1-sgRNA-2感染的MCF-7細胞仍存在減弱的蛋白條帶，這表示插入的干擾序列未能完全抑制ROCK1蛋白的表達。在LV-ROCK1-sgRNA-3感染的MCF-7細胞的對應位置未見到明顯蛋白條帶，表明ROCK1敲除乳腺癌細胞模型構建成功。在劃痕實驗以及Transwell實驗中，與LV-NC對照組相比，被LV-ROCK1-sgRNA-3感染的細胞在侵襲及轉移方面的能力顯著降低。

綜上所述，區別于其他應用抑制劑抑制ROCK1作用的研究實驗，本研究用Cas9的方法敲除了ROCK1基因，探究ROCK1基因的敲除對乳腺癌細胞侵襲轉移能力的影響。通過Transwell實驗和劃痕實驗，本研究發現相較于對照組，ROCK1基因敲除的細胞株遷移和侵襲能力明顯減弱，ROCK1基因的失活突變可以抑制乳腺癌細胞的侵襲和遷移能力，實驗結果與其他研究的觀點相符，說明ROCK1在乳腺癌的侵襲和轉移中發揮重要作用，為后續鑒定ROCK1直接調控的靶基因，研究其參與乳腺癌細胞侵襲轉移的分子機制建立了穩定的細胞模型。