基于TCGA數據庫分析叉頭盒蛋白FoxO1在前列腺癌中的表達及其作用

胡 婕，巢健茜*

(東南大學公共衛生學院醫療保險教研室，江蘇南京 210009)

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是男性中最常見的惡性腫瘤之一，在過去幾十年中，前列腺癌的發病率一直在增加，其在美國男性癌癥相關死亡的主要原因中排第3位[1-2]。近年來，我國男性前列腺癌發病率也呈逐漸上升趨勢，并且發病年齡逐漸趨向年輕化，這對我國男性健康產生了嚴重威脅[3]。有研究顯示，在65歲以上老年人中，約30%患有前列腺癌，很多患者是在中晚期才確診，雖然大多數PCa患者預后相對較好，但治療后復發或轉移的PCa患者預后較差[4]。因此，鑒定與PCa相關的標志物將有助于正確的臨床決策以及改善PCa患者的預后。

叉頭盒(Fox)蛋白是轉錄因子家族成員，其特征在于存在高度保守的“叉頭”或“翼狀螺旋”DNA結構域。Fox家族中存在多個轉錄因子，均具有相似的DNA結構——含有110個氨基酸殘基的保守序列[5-6]。最近的研究表明Fox家族參與惡性腫瘤轉移過程，Fox蛋白具有雙重作用，因為它可以與相同靶DNA序列的啟動子區競爭性結合以影響轉錄，部分家族成員甚至既可以作為腫瘤抑制基因，同時在其他腫瘤中又對致癌基因有調節作用，介導腫瘤惡性生物學的各種表型[7-8]。已有研究發現，FoxA1、FoxK1和FoxJ1等是PCa復發與轉移的潛在標志物[9-11]。然而，FoxO1在PCa中的作用尚未明確。

在本項研究中，我們旨在探討FoxO1在前列腺組織中的表達，并分析FoxO1表達與PCa患者臨床病理特征之間的關系。通過癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)公共數據集研究FoxO1對前列腺癌預后的影響，為進一步研究FoxO1在腫瘤發生發展中的作用機制提供線索和思路。

1 資料與方法

1.1 數據資料收集

通過cBioPortal網站(http://www.cbioportal.org)從TCGA數據集下載并預處理前列腺癌數據集的mRNA表達RNAseq或基因表達微陣列的數據以及臨床病理學數據，進行病理相關性分析和預后分析。

1.2 利用GEPIA分析FoxO1基因表達水平

GEPIA網站(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)是由北京大學最新開發的交互式Web服務器，用于分析來自TCGA和GTEx項目的9 736個腫瘤樣本和8 587個正常樣本的RNA序列表達數據[12]。GEPIA網站提供了可定制的功能：比如腫瘤和正常組織的差異表達分析。因此我們在PCa(197例)及正常前列腺組織中(100例)分析了FoxO1基因的RNA表達水平，并且用箱形圖來展示結果。

1.3 利用人類蛋白質表達圖譜數據庫分析FoxO1的蛋白表達

人類蛋白質表達圖譜(The Human Protein Atlas，https://www.proteinatlas.org)是基于RNA測序分析和免疫組化分析的大型轉錄組和蛋白組數據庫，是瑞典2003年發起的項目[13]，可用于組織和細胞系的免疫染色，也可用于分析正常組織和腫瘤組織蛋白的差異表達[14]。本研究引用網站中FoxO1免疫組化抗體(CAB022326)對正常前列腺組織和PCa組織進行免疫組化實驗，分析FoxO1在正常前列腺組織和PCa組織中的蛋白表達。

1.4 統計學方法

對197例PCa樣本建立患者臨床資料庫，將患者年齡、飲酒情況、TNM分期、腫瘤分化程度和FoxO1表達水平等指標量化賦值后進行統計學分析。臨床病理相關資料分析采用卡方檢驗，對PCa組織中mRNA和蛋白水平的變化情況，建立PCa患者生存曲線，采用Log-rank檢驗比較不同FoxO1表達水平患者生存曲線的差異。單因素和多因素分析采用Cox回歸模型，分析前列腺癌患者臨床指標對前列腺癌患者預后的影響；根據表達譜數據，對樣本的FoxO1表達進行由低到高排序，將高于中位數的值定義為高表達，低于中位數的值定義為低表達，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 FoxO1 mRNA在PCa組織中的表達

使用GEPIA平臺分析FoxO1 mRNA表達水平的結果見圖1。與正常前列腺組織相比，FoxO1 mRNA在PCa組織中表達顯著降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。

圖1 FoxO1 mRNA在PCa和正常前列腺組織中的表達

2.2 FoxO1 mRNA表達與PCa臨床病理指標的關系

在TCGA數據集中，FoxO1 mRNA的表達與TNM分期中T分期(腫瘤浸潤深度)、M分期(遠處轉移)以及分化程度顯著相關(P<0.05)，而與年齡、飲酒等情況無明顯相關關系，見表1。

表1 FoxO1 mRNA表達與前列腺癌臨床病理特征的相關性分析

2.3 FoxO1 mRNA表達與PCa患者預后的關系

本研究中共197例PCa患有相應的預后信息，應用GEPIA檢測了FoxO1 mRNA與PCa患者預后的關系，結果顯示，FoxO1 mRNA表達水平與預后存在相關關系(P<0.05)，FoxO1 mRNA表達水平越低，患者預后越差。在早期，FoxO1 mRNA低表達與高表達的PCa患者總生存率無顯著差異(P>0.05)，后期隨著時間推移，FoxO1 mRNA低表達者總生存率顯著下降(圖2A)。而FoxO1 mRNA低表達者無病生存率始終明顯低于FoxO1 mRNA高表達的PCa患者(P<0.05，圖2B)。以上結果顯示，FoxO1可能是PCa的腫瘤抑制基因，其低表達與患者生存期縮短顯著相關。運用Cox回歸法分析患者生存狀況的影響因素。結果表明年齡、T分期(腫瘤浸潤深度)、分化程度、FoxO1 mRNA表達可作為PCa患者預后的獨立影響因素，見表2。

2.4 FoxO1蛋白在PCa組織中的表達情況

利用Atlas蛋白(免疫組化)數據庫，分析在正常前列腺組織和PCa組織中FoxO1蛋白的表達，免疫組化結果如圖3所示，FoxO1蛋白在正常前列腺組織中染色程度較高，而在PCa中呈較低水平。說明FoxO1蛋白表達水平在PCa組織中較正常前列腺組織降低。

圖2 PCa患者FoxO1 mRNA表達的生存期曲線

表2 影響前列腺癌患者預后的危險因素分析

3 討論

前列腺癌(PCa)現已成為除膀胱癌、腎腫瘤外的第3大常見多發于男性泌尿生殖系統的惡性腫瘤，并且缺乏有效的治療手段[15]。PCa具有發病隱匿，進展緩慢等特點，早期癥狀不明顯，出現癥狀時診斷大多已到中晚期階段。目前對于PCa的診斷主要通過前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)檢測及經直腸超聲引導下前列腺穿刺活檢，其檢測的靈敏度和特異度較差，存在篩查不足或過度診斷等問題。因此，尋找高靈敏度和特異度的生物標志物，提高PCa診斷準確性是當前PCa研究工作的當務之急。

FoxO1是叉頭轉錄因子亞組的一個成員，已被證明在各種生理和病理過程中具有重要作用，包括DNA修復、細胞周期停滯、能量代謝、細胞凋亡、氧化壓力和抵抗[16]。多項研究顯示，FoxO1作為一種重要的轉錄因子可抑制多種腫瘤的發生并削弱幾種實體癌的轉移和侵襲能力。羅娟等[17]發現，FoxO1通過磷酸化、乙酰化等翻譯后修飾調節靶基因的表達參與非小細胞肺癌細胞的凋亡、細胞周期阻滯、DNA損傷修復等生物學過程，從而抑制非小細胞肺癌的發生發展，因此，增強FoxO1表達或修復FoxO1活性是抑制非小細胞肺癌細胞增殖的重要因子。Fan等[18]的研究發現，miR-370能夠調節乳腺癌細胞的遷移能力，而這個過程是通過FoxO1實現的，過表達miR-370后，FoxO1水平下降，細胞遷移能力增強。Zhao等[19]研究發現了FoxO1的另一種抑癌機制，在結腸癌中FoxO1被乙酰化并轉移至細胞質中，胞質中的FoxO1能增強細胞的凋亡和自噬而起到抗癌作用。

本研究利用TCGA數據集，分析PCa中FoxO1的表達與PCa預后的關系。我們首先比較FoxO1在PCa組織和正常前列腺組織中的表達：在GEPIA平臺中分析TCGA數據，發現FoxO1 mRNA水平在PCa中顯著低表達；且FoxO1 mRNA的表達與腫瘤浸潤深度和分化程度相關，即惡性程度越高的患者FoxO1 mRNA表達水平越低；生存分析結果顯示FoxO1 mRNA表達和預后生存之間具有相關性，FoxO1 mRNA低表達患者的預后顯著差于高表達患者；多因素Cox回歸分析顯示FoxO1可以作為判斷PCa患者預后的獨立影響因素，在Atlas蛋白數據庫中從蛋白質表達水平進一步證實FoxO1在PCa中低表達，上述結果提示FoxO1基因在前列腺癌中有可能作為臨床預后指標。

綜上所述，本文通過對TCGA轉錄組測序數據庫的挖掘，表明FoxO1可能成為PCa的診斷標志物以及治療靶標。同時表明FoxO1基因在PCa中可能是一個潛在的抑癌基因，有必要進一步去研究該基因在PCa中的機制及功能，為FoxO1在腫瘤中的基礎和臨床研究提供線索和依據，亦為PCa的靶向治療提供新思路。