氟達拉濱與TRAIL聯用誘導肺癌細胞凋亡及其作用機制

王子依，張露露，孫震曉*，劉長振，*

(1．北京中醫藥大學生命科學學院，北京100029；2．中國中醫科學院醫學實驗中心，中醫藥防治重大疾病基礎研究北京重點實驗室，北京 100700)

肺癌是當今世界最常見的惡性腫瘤之一，近年來發病率和死亡率均呈明顯增加的趨勢[1]。氟達拉濱(Fludarabine)作為一種傳統的抗腫瘤藥物，不僅對多種腫瘤細胞有較強的抑制作用，還對正常細胞具有較強的毒性[2]。腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand，TRAIL)對多種腫瘤細胞有較強的特異增殖抑制作用，且對正常組織和細胞無明顯毒性，但部分腫瘤細胞對其耐受，包括A549等細胞[3]。本研究通過檢測Fludarabine在低濃度下與TRAIL聯合處理對A549細胞凋亡的影響，以證實Fludarabine在低濃度下是否可以增加A549對TRAIL的敏感性，促進A549細胞的凋亡，以期為藥物的聯合處理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

Fludarabine標準品購自Selleck公司。人肺癌細胞A549及人臍靜脈內皮細胞HUVEC均為中國中醫科學院醫學實驗中心免疫學實驗室保存。RPMI-1640培養基、胰酶、PBS購自HyClone公司，ECM培養基購自Sciencell公司，胎牛血清購自Gibco公司，CCK-8試劑盒購自Dojindo公司，Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自Biolegend公司。caspase-3、caspase-8、Bcl-2、Bcl-xL、Suvivin、JNK、p-JNK、p38、p-p38單克隆抗體均購自Abcam公司，抗兔IgG二抗、兔源GAPDH單克隆抗體均購自CST公司。

1.2 細胞培養

實驗所用人肺癌細胞A549使用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養基，人臍靜脈內皮細胞HUVEC使用ECM培養基，兩種細胞均在37℃、CO2體積分數為5%條件下進行常規培養，2~3 d傳代1次。所有實驗均在細胞對數生長期進行。

1.3 CCK-8法檢測A549細胞及HUVEC細胞抑制率

實驗分為對照組、Fludarabine組、TRAIL組和Fludarabine及TRAIL聯合組，每組設3個復孔。取對數生長期A549細胞或HUVEC細胞分別接種于96孔板中(每孔5×103個細胞)，12 h后棄去培養液。對照組加入RPMI-1640完全培養基或ECM完全培養基(A549細胞使用RPMI-1640完全培養基，HUVEC細胞使用ECM完全培養基)100 μL；Fludarabine組分別加入含25或50 μmol/L Fludarabine的培養基100 μL，培養12 h后再次棄去培養液；TRAIL組加入含50 ng/mL TRAIL的培養基100 μL；Fludarabine和TRAIL聯合組分別加入含25或50 μmol/L Fludarabine和50 ng/mL TRAIL的培養基100 μL。培養12 h后，每孔加10 μL CCK-8檢測試劑，繼續培養1～4 h，全自動酶標儀測定各孔D(450)值，按下式計算細胞抑制率。

細胞抑制率(%)=[D(450)對照組-D(450)實驗組]/D(450)對照組×100%

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡情況

分組設置同前，取對數生長期的A549細胞，以每孔5×105個細胞鋪于6孔板，培養12 h后棄去培養液，對照組加入RPMI-1640完全培養基，Fludarabine組加入含25 μmol/L Fludarabine的培養基，培養12 h后再次棄去培養液，TRAIL組加入含50 ng/mL TRAIL的培養基，Fludarabine+TRAIL聯合組加入含25 μmol/L Fludarabine+50 ng/mL TRAIL的培養基。培養4 h后收集細胞，用0.5 mL結合液重懸細胞，加入5 μL AnnexinV-FITC及10μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)，混勻后室溫避光反應15 min，用流式細胞儀(Accuri C6，BD)分析細胞凋亡率。以右下象限為早期凋亡細胞，其比率判定為凋亡率。

1.5 Western blot分析凋亡相關蛋白表達量

選取對數生長期細胞，接種于直徑6 cm的細胞培養皿內(每皿1×106個細胞)。分組及處理方式同1.3。收集細胞，用30 μL細胞裂解液冰浴裂解30 min，10 000 r/min離心10 min收集上清。BCA法測定樣品濃度后，經12%SDS-PAGE電泳分離，濕電轉移至PVDF膜，室溫下封閉1.5 h，分別加入caspase-3、caspase-8、Bcl-2、Bcl-xL、Suvivin、JNK、p-JNK、p38、p-p38和GAPDH一抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，加入抗兔IgG二抗，室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，用ECL發光法獲得蛋白條帶，以GAPDH為內參分析目標蛋白的表達，采用Image Lab軟件分析各蛋白表達量變化。

1.6 統計學方法

所有實驗數據采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，對照組和加藥組D(450)值或早期凋亡率差異采用t檢驗分析。α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 Fludarabine和TRAIL單獨或聯合處理對A549和HUVEC細胞增殖的影響

CCK-8實驗結果見圖1，可見25或50 μmol/L Fludarabine對A549細胞增殖無明顯影響，50 ng/mL TRAIL對A549細胞的抑制率為6.2%。當25或50 μmol/L Fludarabine分別與50 ng/mL TRAIL聯用后，對A549細胞的抑制率分別為30.9%和44.9%，顯著高于Fludarabine或TRAIL單獨處理(P<0.01)，說明Fludarabine能夠使A549細胞對TRAIL的敏感性增加。Fludarabine和TRAIL單獨或聯合處理對HUVEC細胞增殖無明顯影響，與對照組相比差異均無統計學意義(P>0.05)。

圖1 Fludarabine和TRAIL單獨或聯合處理對A549和HUVEC細胞增殖的影響

2.2 Fludarabine和TRAIL單獨或聯合處理對A549細胞凋亡的影響

流式細胞術檢測結果見圖2，可見25 μmol/L Fludarabine和50 ng/mL TRAIL分別誘導A549細胞的凋亡率依次為11.1%和5.2%，二者聯合處理后，細胞凋亡率為89.3%；而且進一步Western blot檢測發現Fludarabine和TRAIL聯合作用后A549細胞中procaspase-8和procaspase-3蛋白表達均下降，而cleaved caspase-8表達上升(圖3)。說明Fludarabine聯合TRAIL可增加肺癌細胞凋亡。

圖2 Fludarabine和TRAIL單獨或聯合應用對A549細胞凋亡的影響

2.3 Fludarabine和TRAIL單獨或聯合用藥對A549細胞有關信號通路的影響

Western blot結果見圖4，25 μmol/L Fludarabine和50 ng/mL TRAIL聯合處理引起A549細胞增殖蛋白Survivin和抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl水平降低，而引起JNK和p-p38水平升高。說明Fludarabine聯合TRAIL可抑制肺癌細胞抗凋亡蛋白水平，而激活JNK和p38。

3 討論

TRAIL是新發現的TNF超家族成員，能迅速誘導表達TRAIL特異受體的細胞發生凋亡。TRAIL可以選擇性的殺傷腫瘤細胞，對正常細胞傷害較少[4-5]。然而，隨著研究不斷深入，人們發現部分腫瘤細胞對TRAIL并不敏感，這使得TRAIL在對這些腫瘤的治療中受到極大的限制[6]。而TRAIL與其他傳統抗腫瘤藥物的聯合處理極大的改善了這一情況。

圖3 Western blot檢測caspase-8和caspase-3蛋白表達

圖4 Fludarabine和TRAIL單獨或聯合用藥對A549細胞有關信號通路的影響

Fludarabine是一種對B-細胞慢性淋巴細胞白血病有顯著療效的抗腫瘤藥物，副作用明顯[2]。本研究發現Fludarabine低濃度下處理過的A549細胞再與TRAIL聯合作用，可以使A549細胞對TRAIL的敏感性增加，A549細胞凋亡率明顯上升，提示臨床上Fludarabine與TRAIL聯用可能會提高肺癌的治療效果。

Caspase-8為死亡受體途徑中重要成員之一，在細胞凋亡中發揮重要作用[7]。Fludarabine與TRAIL聯用可使procaspase-8裂解為有活性的caspase-8，并能使procaspase-3裂解為有活性的caspase-3，有活性的caspase-3可以直接誘導細胞凋亡，這是誘導A549細胞凋亡的原因之一。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的重要成員，具有腫瘤特異性，作為負調控因素參與內源性和外源性凋亡途徑，可直接抑制caspase-3的表達[8]。Fludarabine與TRAIL聯用能夠顯著抑制A549細胞中Survivin的表達，激活caspase-3，說明Fludarabine與TRAIL聯用可能通過抑制Survivin的表達促進caspase-3的激活，從而增加A549細胞的凋亡。Bcl-2、Bcl-xL為Bcl-2家族中抑制細胞凋亡的蛋白，Bcl-2和Bcl-xL在線粒體上形成離子通道，參與凋亡調節，并且可以誘導caspases的激活，本研究發現Fludarabine與TRAIL聯合處理可以導致A549細胞中Bcl-2、Bcl-xL表達量降低，說明Fludarabine與TRAIL聯用也可能通過抑制Bcl-2、Bcl-xL表達誘導A549細胞凋亡。JNK和p38為MAPKs重要成員，MAPKs信號轉導通路存在于大多數細胞內，有研究表明MAPKs的激活可以增加細胞對TRAIL的敏感性[9]。我們的研究結果表明Fludarabine與TRAIL聯合處理可以促進JNK和p38的激活，而JNK及p38的激活同樣能夠誘導caspases的激活，說明Fludarabine與TRAIL聯用還可以通過MAPKs信號通路促進A549細胞的凋亡。

Fludarabine與TRAIL聯用增強B-淋巴細胞性腫瘤細胞的殺傷作用已有研究，其作用機制為Fludarabine與TRAIL聯用可以使DR5增高，從而導致細胞凋亡[10]，而本研究發現低濃度下Fludarabine增加A549細胞對TRAIL的敏感性的作用機制為通過對Bcl-2家族部分成員的作用及MAPKs的激活來增加A549細胞的凋亡率達到抑制細胞活力的效果，并且對正常細胞HUVEC無明顯抑制作用，為進一步探索抗腫瘤藥物與TRAIL聯合處理增加TRAIL的抗腫瘤效果提供了新的思路。