miR-200b-3p和PAK2 mRNA在耐藥卵巢癌組織中的表達及其臨床意義

萬樹泉，魏麗軍*，王福花，曾 勇

(1．山西醫科大學第二臨床醫學院，山西 太原030001；2．山西醫科大學附屬腫瘤醫院婦一科，山西 太原 030013；3．山西醫科大學附屬腫瘤醫院分子生物室，山西 太原 030013)

卵巢癌是女性生殖系統惡性腫瘤之一，在全球的發病率和死亡率均僅次于宮頸癌[1]。由于缺乏早期癥狀和缺乏有效的早期篩查診斷方法，多數卵巢癌患者發現時已是晚期，5年生存率僅有20%~25%[2]。其主要治療手段是腫瘤細胞減滅術加紫杉醇和鉑類藥物等化療藥的聯合治療，近些年盡管診斷和治療技術的發展，死亡率仍無明顯改善，其主要原因之一是化療耐藥。探尋耐藥性卵巢癌新特異性的分子標志物，為其逆轉化療耐藥開辟新途徑提高治愈率已成為研究熱點。Lee等[3]在秀麗隱桿線蟲中發現能夠按時序調控胚胎后期發育的第1個miRNA分子lin-4。后續系列研究證明了miRNA是一類重要的調控因子，可以通過結合靶mRNA的3′UTR導致mRNA降解或翻譯抑制從而調節基因的表達，可參與細胞增殖、分化、凋亡、新陳代謝等生理過程[4]，也可參與惡性腫瘤的細胞增殖、侵襲、轉移和化療耐藥/敏感等病理過程[5-6]。微小RNA(microRNA)的發現及其功能作用的揭示為上皮性卵巢癌多藥耐藥機制的研究帶來了新的思路。

前期實驗用miRNA基因芯片篩選出上皮漿液性卵巢癌耐藥組織中miR-200b-3p表達上調，在此基礎上選用目前常用的3個miRNA靶基因預測數據庫：DIANA TOOLS、 miRTarBase、 TargetScanHuman miRNA進行miR-200b-3p靶基因預測并取交集，結合參考文獻，初步選取PAK2為miR-200b-3p可能作用的靶基因，本實驗采用實時定量PCR的方法檢測與化療耐藥相關的差異表達miRNA-200b-3p，并闡明其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 組織標本

收集2015—2018年在山西省腫瘤醫院就診的50例上皮漿液性卵巢囊腺癌患者(25例化療敏感和25例化療耐藥)為研究對象。并定義耐藥組為處理組，敏感組為對照組。所有患者均符合以下納入標準：①經過病理驗證且之前未經過任何治療(化療、生物治療和免疫治療等)；②所有取材患者均已接受腫瘤細胞減滅術和術后3~6個周期的紫杉醇和順鉑(TP/TC)藥物治療；③臨床資料完整者。根據2012年卵巢癌NCCN指南來鑒定化療敏感和化療耐藥，腫瘤細胞減滅術后對初次化療有明確反應，并達到臨床完全緩解，停用化療藥6個月后復發者認為是化療敏感，而卵巢癌術后初次化療后6個月內復發認為是化療耐藥。卵巢癌復發指標：①CA125水平升高；②出現胸水和腹水；③體檢發現腫塊；④找不到原因的腸梗阻；⑤影像學發現腫塊。如果滿足以上兩條或者兩條以上指標，就可以認為卵巢癌復發。對懷疑可能復發的病人，有必要做CT、MRI甚至PET。術中收集新鮮的卵巢癌組織樣本在離體后30 min內完全浸泡于RNA保存液中，并放入4℃冰箱過夜，隨后倒去RNA保存液，置于-80℃冰箱中保存方便后續進行統一操作。這項研究得到了山西醫科大學附屬腫瘤醫院支持及患者的知情同意。

1.2 主要試劑和儀器

RNAiso Plus，購于日本TaKaRa公司；the First Strand cDNA Synthesis Kit，無RNA酶水，均購于北京Tiangen?公司；SYBR?Select Master Mix，購于美國ABI公司；三氯甲烷/氯仿，購于天津福晨化學試劑公司；異丙醇，購于天津科密歐化學試劑公司；乙醇(75%、95%)，購于山西太原康久醫藥輔料福利公司；Nanodrop 2000/2000c，購于美國Themofisher Scientific公司；ViiA7 PCR儀，購于美國ABI公司；全自動樣品冷凍研磨儀，購于上海凈信實業有限公司；高速低溫離心機，購于德國Eppendrof公司。

1.3 實時熒光定量PCR檢測

取小塊凍存的卵巢癌組織研磨、裂解、提取出總RNA。用Nanodrop儀檢測總RNA濃度。嚴格按照ABI反轉錄試劑盒的說明書進行。將提取的總RNA反轉錄成cDNA，分別選取U6為內參，反應條件為：25℃、10 min，37℃、120 min，85℃、5 min，所得cDNA直接進行RT-PCR。嚴格按照miScript SYBR Green PCR試劑盒說明書制備20 μL qPCR反應體系，并使用美國ABI公司的ViiA7 PCR儀進行PCR擴增。miR-200b-3p引物序列：上游5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；下游5′-UAAUACUGCCUGGUAAUGAU-3′。PAK2基因引物序列：上游5′-CACCCGCAGTAGTGACAG AG-3′；下游 5′-GGGTCAATTACAGACCGTGTG-3′。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；反應條件：95℃、5 min，95℃、45 s，60℃、30 s，40個循環，數據分析采用2-ΔΔCT法表示相對定量結果。△CT=CT，miRNA-CT，U6/p-actin，△△CT=△CT，耐藥組-△CT，敏感組。表示miR-200b-3p、PAK2 mRNA在卵巢癌組織中的相對表達水平。

1.4 miR-200b-3p和PAK2 mRNA表達水平與上皮性漿液性卵巢癌患者的臨床病理指標分析

分析miR-200b-3p、PAK2 mRNA表達水平和上皮漿液性卵巢癌患者年齡、臨床分期、病理分化程度、淋巴結轉移、血管侵襲和腹水中癌細胞檢出情況的關系。

1.5 統計學方法

數據分析用 SPSS 22.0。采用 2-ΔΔCT法表示相對定量結果，計量資料采用xˉ±s表示，使用t檢驗進行比較。計數資料采用例數或百分比表示，采用χ2檢驗，α=0.05作為檢驗水準。Spearman法分析miR-200b-3p和PAK2 mRNA相對表達水平的相關性。

2 結果

2.1 卵巢癌患者基本信息表

敏感組和耐藥組各有25名研究對象，敏感組平均年齡為(53.4±7.0)歲，耐藥組平均年齡為(57.3±7.3)歲，兩組間年齡差異無統計學意義(P=0.056)。耐藥組淋巴結無轉移的情況明顯高于敏感組，差異具有統計學意義(P<0.01)。其余指標的差異均無統計學意義。

表1 敏感組和耐藥組患者的基本資料

2.2 miR-200b-3p、PAK2mRNA和內參 U6、GAPDH的擴增曲線及熔解曲線

擴增曲線均呈現S型曲線，miR-200b-3p和內參U6的擴增趨勢和擴增程度相似，兩者曲線基本是平行移位，提示miR-200b-3p和內參U6的擴增效率基本一致(圖1)；同樣，PAK2 mRNA和內參GAPDH的擴增趨勢和擴增程度相似，兩者曲線基本是平行移位，PAK2 mRNA和內參GAPDH的擴增效率基本一致(圖3)。熔解曲線都表現為單一的峰值，提示miR-200b-3p、PAK2 mRNA和內參U6、GAPDH的引物特異性好(圖2、圖4)。

圖1 miR-200b-3p和內參U6的擴增曲線

圖2 miR-200b-3p和內參U6熔解曲線

圖3 PAK2 mRNA和內參GAPDH的擴增曲線

圖4 PAK2 mRNA和內參GAPDH的熔解曲線

2.3 miR-200b-3p和PAK2 mRNA在卵巢漿液性囊腺癌組織中的表達量

熒光定量PCR(qPCR)結果顯示，miR-200b-3p在25例化療耐藥卵巢漿液性囊腺癌組織的△CT為3.71±0.98，顯著高于化療敏感卵巢漿液性囊腺癌組織，耐藥組相對表達量(2-ΔΔCT)是敏感組的15.78倍，差異具有統計學意義(P<0.05，表2，圖1A)。耐藥組卵巢癌組織PAK2的表達量顯著低于敏感組卵巢癌，是敏感組表達的0.03，差異具有統計學意義(P<0.05，表2，圖3、4)。

表2 不同組別miR-200b-3p和PAK2 mRNA水平的比較(n=25)

2.4 miR-200b-3p和PAK2 mRNA表達的相關性

miR-200b-3p和PAK2 mRNA的相對表達水平作Spearman相關分析，得相關系數r=-0.560，P<0.01，可見miR-200b-3p的相對表達量與PAK2 mRNA呈負相關。

2.5 卵巢癌組織中miR-200b-3p和PAK2 mRNA的表達與臨床病理指標的關系

按照不同臨床特征對研究對象進行分組，并用t檢驗比較兩組之間miR-200b-3p和PAK2 mRNA平均相對表達量，檢驗水準α=0.05，有淋巴結轉移的患者miR-200b-3p明顯高于未轉移的患者(P<0.01)，但是PAK2 mRNA的情況與之相反，有淋巴結轉移的患者PAK2 mRNA表達量明顯低于無淋巴結轉移患者(P<0.01)。臨床病理分期I-II和III-IV的miR-200b-3p和PAK2 mRNA平均相對表達量差別具有統計學意義，且I-II的miR-200b-3p高于III-IV的患者，PAK2 mRNA與之相反。其余分化程度、血管侵犯和癌細胞的分組差別均無統計學意義。結果提示miR-200b-3p和靶基因PAK2 mRNA的表達水平與病理分期、淋巴結轉移具有顯著的相關性，而與年齡、分化程度、有無血管侵犯以及是否發現癌細胞均無明顯相關關系(P>0.05，表3)。

表3 卵巢癌患者miR-200b-3p和PAK2 mRNA相對表達量與臨床病理指標之間的關系

3 討論

上皮漿液性卵巢癌是一類婦科生殖系統惡性腫瘤，確診晚、死亡率高、晚期患者5年生存率不足30%。腫瘤細胞減滅術聯合化療是治療卵巢癌的重要治療方式。化療耐藥是導致卵巢癌患者預后不良的主要原因。microRNA(miRNA)是一類長度約為21~25個核苷酸的非編碼小分子RNA，具有高度保守性、組織特異性和時序性。miRNA的作用機制是降解靶mRNA或抑制其翻譯，在轉錄后水平調控基因表達、細胞增殖分化以及腫瘤的發生發展[7]。在本實驗中收集25例卵巢癌化療耐藥患者組織樣本和25例卵巢癌化療敏感患者組織樣本，采用實時熒光定量PCR法檢測miR-200b-3p及其靶基因PAK2的相對表達量，qPCR的結果顯示miR-200b-3p在化療耐藥組中表達明顯上調；耐藥組卵巢癌組織PAK2的表達量顯著低于敏感組卵巢癌患者。Spearman等級相關分析發現miR-200b-3p的相對表達量與PAK2 mRNA呈負相關，該實驗結果提示miR-200b-3p在化療耐藥性卵巢癌中過表達，其機制可能是通過靶向調控PAK2參與調節化療耐藥和促進卵巢癌轉移。文獻報道miR-200b過表達促進腫瘤化療耐藥和轉移，Meng等[8]首次提出miR-200b在膽管癌中過表達與化療耐藥相關，抑制miR-200b的表達可以提高膽管癌細胞對吉西他濱的敏感性。但是大量文獻報道了miR-200b過表達可以增強化療敏感性。如Yang等[9]發現，在對阿霉素具有抗性的MCF-7乳腺癌細胞中，miR-200b過表達可抑制上皮間質轉化(EMT)和增加對多柔比星的敏感性。miR-200b在化療耐藥乳腺癌、骨肉瘤細胞中靶向調節FN1可增加化療敏感性[10]。Brozovic等[11]研究發現在耐紫杉醇卵巢癌細胞OVCAR-3/TP和MES-OV/TP中，miR-200家族抑制EMT，產生了對卡鉑的抗性，同時miR-200s的重新轉染不能完全逆轉EMT，在OVCAR-3/TP中恢復紫杉醇敏感性，但在MES-OV/TP中卻沒有改變。miR-200b失調與腫瘤化療耐藥之間的關系有以下幾種可能的機制：①miR-200b可以通過影響上皮間充質轉化參與腫瘤化療耐藥；②腫瘤干細胞具有促進腫瘤化療耐藥的作用，miR-200b可以通過干擾腫瘤干細胞的維持來參與腫瘤耐藥，腫瘤干細胞具有促進腫瘤化療耐藥的作用；③miR-200b可以作為血管生成抑制劑降低血管內皮生長因子參與化療耐藥。在實驗中，我們還發現miR-200b-3p的過表達與上皮性卵巢癌的臨床分期，淋巴結轉移有顯著相關性，說明miR-200b-3p過表達可能與上皮性卵巢癌化療耐藥、遷移有關，大量文獻研究表明miR-200s表達水平與化療耐藥有關，具有復雜性、細胞環境和藥物依賴性。但是我們并未查到miR-200b-3p表達與卵巢癌化療耐藥具有相關性的文獻，本實驗為卵巢癌化療耐藥治療提供新的方向，miR-200b-3p可能可以作為卵巢癌的潛在治療靶點。

在生物信息學分析中[12]，我們利用多種miRNA靶基因預測軟件預測到了307個靶基因，再進一步對預測到的靶基因行GO分析和KEGG Pathway分析，并結合藥物代謝相關理論和化療耐藥相關文獻分析靶基因。靶基因GO分析結果顯示正調控含核酸堿基化合物代謝過程、正調控高分子代謝過程及細胞死亡可能與化療耐藥及藥物代謝存在相關性。對預測到的靶基因行KEGG Pathway分析結果顯示MAPK信號通路、ErbB信號通路可能參與化療耐藥發生機制。MAPK是絲裂原活化蛋白激酶，是一種參與調節細胞的生長、分化、應激、炎癥等多種生理/病理效應的絲/蘇氨酸蛋白激酶，具體信號傳導有4種主要分支路線：ERK、JNK、p38MAPK、ERK5。Peng等[13]發現 miR-299-5p通過GOLPH3/MAPK/ERK軸之間抑制細胞凋亡，增強了膠質母細胞瘤細胞在體外和體內對替莫唑胺的耐藥性。Zhou等[14]發現c-Jun激活可抑制食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)細胞生長并誘導細胞凋亡，從而抑制P-gp的表達，并通過激活p53信號傳導途徑增強p21表達，從而增加對順鉑的敏感性。ErbB蛋白屬于跨膜酪氨酸激酶的表皮生長因子受體家族成員。該家族成員包括ErbB1(又稱 為 EGFR/HER1)、 ErbB2(HER2)、 ErbB3(HER3)、ErbB4(HER4)。EGFR活化后可以通過激活PI3K/AKt下游信號通路參與腫瘤的增殖、分化、凋亡、轉移等生物學行為[15-16]。綜上所述，MAPK信號通路、ErbB信號通路均參與化療耐藥發生，兩者均可作為后續機制研究的方向。同時靶基因PAK2均參與了這兩條信號通路，因此，我們選擇miR-200b-3p和它潛在的靶基因PAK2作為接下來的研究方向。

PAK2是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是PAKs家族成員之一，在各組織器官中廣泛表達[17-18]，在運動、存活、有絲分裂和細胞凋亡等生理過程中起著重要作用。Li等[19]發現人類乳腺癌細胞系和人乳腺癌組織中PAK2表達較高，高表達的PAK2可以通過負調節降低caspase-7活性，從而抑制細胞凋亡，在人乳腺浸潤性導管癌中介導化學治療抗性。p21激活的激酶(PAKs)在具有獲得性耐藥性的轉移性黑素瘤細胞中被激活，并且在化療耐藥中起關鍵作用[20]。在本實驗中，我們發現PAK2 mRNA表達水平在耐藥性卵巢癌組織中下調，miR-200b-3p和PAK2 mRNA的表達呈負相關。我們還發現低PAK2 mRNA表達與卵巢癌臨床分期、淋巴結轉移有顯著的相關性，這說明低PAK2 mRNA表達水平與上皮性卵巢癌侵入和遷移有關。綜合以上的實驗結果和討論，我們發現miR-200b-3p在化療耐藥卵巢癌組織中上調，可能通過誘導PAK2 mRNA下調參與上皮漿液性卵巢癌的化療耐藥，miR-200b-3p和PAK2與上皮漿液性卵巢癌化療耐藥、侵襲轉移有潛在的關系。當然這是一個簡單的推斷。因此，我們要進一步去研究具體的調節機制。